[发明专利]一种提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，尤其是一种利用明胶强化关键氨基酸丰度以提升生产强度的方法，属于微生物发酵工程领域。

背景技术

维生素C，又称L-抗坏血酸 (L-ascorbic acid)，其工业化生产普遍采用“二步发酵”工艺，即第一步反应与“莱氏法”相同，由D-葡萄糖加氢生成的D-山梨醇先经细菌，如生黑葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter melanogenus)、弱氧化醋酸杆菌 (Acetobacter suboxydans) 或生黑醋酸杆菌 (Acetobacter melanogenum) 发酵转化为L-山梨糖；第二步为“二步发酵法”最主要的特点：由普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare，原来鉴定为Gluconobacter oxydans) 和巨大芽胞杆菌 (Bacillusmegaterium) 组成的混合菌系催化L-山梨糖到维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) 的反应。

在该混菌发酵体系中，只有普通生酮古龙酸菌能合成2-KLG，伴生菌巨大芽孢杆菌不具有合成2-KLG的酶系，但在发酵过程中分泌的某些未知胞内/胞外蛋白对普通生酮古龙酸菌细胞生长有显著的促进作用，从而促进2-KLG产量显著提高。目前，科学界对普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌两菌间的生理关系没有清晰、透彻的理解，从而难以从生理学和工程学角度阐述影响维生素C“二步发酵”过程的规律，进而难以提出更好的控制方法和策略。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高2-酮基-L-古龙酸 (2-KLG) 生产强度的方法。

为解决上述技术问题，在普通生酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)组成的混合菌系中添加明胶强化L-甘氨酸和L-脯氨酸丰度。本发明所用菌株普通生酮古龙酸菌 (Ketogulonigenium vulgare) 和巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)混合菌系(2980)为江苏江山制药提供的菌株（一种2-酮基-L-古龙酸高浓度发酵生产工艺，申请号：200810180630.6）。

所述明胶的浓度为0.5~1.5 g·L^-1。

所述明胶的浓度为0.80 g·L^-1。

具体步骤为：

 (1)“一步发酵”培养

取新鲜黑醋酸杆菌（Acetobacter melanogenum Beijerinck）斜面，接种于“一步发酵”种子培养基 (75 mL/750 mL锥形瓶)，33??C，200 rpm振荡培养16 h。将培养液按10%接种量转接种子罐 (65 L/100 L搅拌罐) 进行扩大培养。初始种子培养基pH值通过2 mol·L^-1醋酸溶液调为5.1~5.5，整个培养过程中不对pH值进行控制，培养温度、搅拌转速及通气量分别设置为35°C，150 rpm和1 vvm (volume/volume/minute)。L-山梨糖含量达85 g·L^-1以上到达终点后，将种子液以10%接种量转接发酵罐 (650 L/1000 L 搅拌罐)，培养条件同上述种子罐。当醇糖转化率达到98%以上即为发酵终点。获得的培养液通过巴氏消毒法 (80°C, 30min) 灭活黑醋酸杆菌，冷却至20~30°C后无菌保存，备用。

(2)“二步发酵”培养