[发明专利]新型甲型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种新型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)参照新型H1N1流感病毒HA基因序列设计特异性引物；

(2)取备检样品提取病毒RNA；

(3)RT-PCR扩增

①反转录合成cDNA：反转录反应体系包括：10×RT mix 2μl，2.5mM dNTPs 2μl，2μl Random，Quant Reverse Transcriptase 1μl，5μl已制备的RNA，DEPC水8μl；37℃作用1h，即反转录完成；

②PCR扩增：PCR总体系为25μl，其中10×Buffer 2.5μl，2.5mM Mg²⁺2μl，2.5mM dNTPs 2μl，上游引物H1F-1和下游引物H1R-1各0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板1μl，余下用灭菌ddH₂O补足；反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃30s，45℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸6min；反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳；

(4)质粒标准阳性模板的制备

①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，按照常规方法将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，菌液PCR鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；

②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；

(5)结果分析，通过ABI7500System SDS Software Version 1.2软件分析收集的荧光曲线判定结果：

提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释(10⁷～10¹copies/μL)用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系20μl，其中2.5×realMasterMix 8μl，上下游引物(H1F-2和H1R-2)各0.6μl，探针0.3μl，20×Probe Enhancer solution 1.0μl，模板2μl，超纯水7.5μl；反应条件为：95℃1min；95℃10s，60℃15s，68℃34s，40个循环；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为1000copies/reaction。

2.根据权利要求1所述的新型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的特异性引物、H1-probe探针序列如下：

H1F-1：TACCCAGGAGATTTCATCGA

H1R-1：GAGGACTTCTTTCCCTTTAT 

H1F-2：5’-AGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGG-3’

H1R-2：5’-TGAGGACATGCTGCCGTTAC-3’

H1-probe：5’-FAM-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-Eclipse-3’。

3.根据权利要求1所述的新型H1N1流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的荧光定量标准品为新型H1N1流感病毒HA基因CY045143.1上335～586之间、大小为252bp的基因片段的质粒。