[发明专利]绵羊Noggin基因的克隆和慢病毒表达载体的构建

说明书

技术领域

本发明涉及绵羊Noggin基因编码区的全长cDNA序列的克隆及慢病毒表达载体的构建。

背景技术

Noggin作为BMPs(bone morphogenetic proteins，骨形态发生蛋白)的拮抗蛋白，是从非洲蟾蜍体内分离，能诱导神经组织发生和腹侧中胚层背侧化。由于它与BMP2和BMP4具有高度亲和力，从而阻止它们与BMP受体的相互作用。因此，BMPs活性受到BMP拮抗蛋白noggin基因的抑制性调节。

目前普遍认为，毛囊的发生也是由表皮干细胞引发的。在毛囊的形成过程中，表皮干细胞通过改变他们的极性以及细胞间的相互联系而启动这一过程。2003年，由洛克斐勒大学HHMI研究所Elaine Fuchs领导的研究人员发现了两个信号分子，即WNT及BMP抑制剂Noggin，能够影响未成熟的干细胞形成毛囊的过程。在之前的研究中，Fuchs将beta-catenin基因导入小鼠生产出具有很多毛囊的转基因老鼠。beta-catenin受Wnt信号通路调节，研究人员证明Wnt能使beta-catenin稳定，而noggin则能阻断BMP的功能，产生Lef1。这样，beta-catenin即可结合并活化Lef1转录复合体，下调E-cadherin基因的表达，降低E-cadherin的水平，从而改变细胞的极性以及细胞间相互连接，引发毛囊的起始过程。如果提高E-cadherin的水平，毛囊则不再形成。这就是说，通过来源于不同类型细胞的WNT及noggin两个影响毛囊形成的信号分子，将细胞外的信号通路与细胞核转录因子联系在一起，共同作用于目标基因，可以重塑细胞间联系、启动毛囊的形成。毛发是少数几个能规律性再生的器官之一，是研究器官再生的主流模式之一，也是目前研究的热点领域。2008年，来自美国南加州大学钟正明教授的研究小组发现，毛发(即使是正常小鼠中的毛发)并不是以个体为单位生长，而是波浪式再生的，这说明毛发干细胞不仅受到一个毛囊中微环境的调控，也被邻近的毛囊、皮肤区间，以及系统激素有等级地进行调控。在分子水平上，BMP和Noggin的表达呈周期性变化。在毛囊生长期，尤其是细胞增殖时，Noggin表达高、BMP表达低；在退行期和不应期，BMP表达高、Noggin表达低。这些发现表明皮肤宏观环境(macro-environment)下，BMP和Noggin的周期性表达在毛发干细胞活性机制中发挥关键作用。当许多毛发再生的时候，毛发必须在它们其间交换活性信号，在宏观环境的不同时间位点，这些干细胞活性受到抑制或者促进。研究人员还发现在转基因小鼠皮肤中过量上表达noggin，毛囊的不应期显著缩短，而毛囊的再生明显加快；将该转基因小鼠的皮肤移植到正常小鼠皮肤则发现，供体和受体皮肤的毛囊会受相互作用影响，其毛囊最终的命运则取决于真皮内BMP的活性；而人为调控皮肤BMP活性即可造成毛囊生长周期的变化。所以，骨形态发生蛋白(BMP)及其拮抗因子Noggin在控制毛囊活动周期中起重要作用。

因此，通过调节Noggin基因的表达干预BMP的活性，能够影响毛囊生长周期，延长毛囊生长期、加快毛囊循环周期的进程。Andrey的研究还发现，Noggin基因的过量表达还将改变毛囊的大小和毛发的形状，这些变化无疑对提高毛产量和品质提供了实验和理论依据。

本发明利用RT-PCR技术扩增出绵羊Noggin基因cDNA全长编码区，进一步构建慢病毒表达载体，利用慢病毒卵周隙注射技术生产转Noggin基因绵羊，以便进一步分析Noggin基因在绵羊毛囊生长发育中的作用。

发明内容

本发明的目的在于：提供的克隆绵羊Noggin基因的cDNA序列和构建慢病毒表达载体，对分析其在细毛羊毛囊生长发育中的功能有重要的科学价值与实践意义。