[发明专利]一种产类胰蛋白酶基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种产类胰蛋白酶基因工程菌，其特征在于染色体上携带有类胰蛋白酶的基因。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述类胰蛋白酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征所述基因工程菌为毕赤酵母GS115。

4.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步：利用PCR技术得到链霉菌属类胰蛋白酶基因；

第二步：将PCR扩增得到的类胰蛋白酶基因片段与毕赤酵母常用表达载体pPIC9K双酶切、连接，得到含有类胰蛋白酶基因的重组质粒；

第三步：将重组质粒电击转化宿主毕赤酵母GS115，构建高效表达类胰蛋白酶的组成型毕赤酵母重组菌株。

5.一种应用权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在接种一环所述基因工程菌入250 mL三角瓶，装液量50 mL的种子培养基，培养温度28℃～30℃，摇床转速200 r / min，培养24h ；离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为 50 mL 发酵培养基的三角瓶中，发酵温度 30℃，摇床转速200 r / min，发酵时间：3～4天。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述种子培养基为（g/L）：种子培养基：蛋白胨 10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5-15。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述所述种子培养基为（g/L）：蛋白胨 15，酵母提取物8，葡萄糖15，氯化钠10。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述所述发酵培养基为（g/L）：酵母氮源基础培养基12～15，生物素0.0002～0.0005，甲醇10～50；微量元素溶液，MnSO₄·4H₂O 100，ZnCl₂ 70，Na₂MoO₄·2H₂O 35，H₃BO₃ 60，CoCl₂·6H₂O 200，CuSO₄·5H₂O 29，NiCl₂·6H₂O 25，37%盐酸0.9 mL 。