[发明专利]一种β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备

权利要求书

1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株糖苷水解酶第12家族(GH12)的新型β-1，4-内切葡聚糖酶基因(Aus cel12A)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.由权利要求1所述的葡聚糖酶基因(Aus cel12A)编码的新型β-1，4-内切葡聚糖酶(AusCel12A)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO：3。

3.Aus cel12A完整mRNA和DNA序列的获取方法：

(1)Aus cel12A 3′端mRNA序列的克隆：首先对Aspergillus kawachii、Aspergillus niger和Aspergillus terreus GH12的β-内切葡聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列，再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物Cel12A-3F1和Cel12A-3F2；

Cel12A-3F1：5′-TA(T/C)GACAG(T/C)GC(G/C)TCGAGCCC-3′

Cel12A-3F2：5′-GTGAA(A/G)AGCTACTC(T/G)AACTC-3′

以A.usamii E001总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Cel12A-3F1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min；以M13 Primer M4和Cel12A-3F2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus cel12A 3′端mRNA序列；

(2)Aus cel12A 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aus cel12A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Cel12A-5R1和Cel12A-5R2；

Cel12A-5R1：5′-TTGTCCTGCTTCCATTCCAC-3′

Cel12A-5R2：5′-ACATCACTCACGAGCTTCTT-3′

以反转录合成的cDNA第一条链为模板、Outer Primer和Cel12A-5R1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Inner Primer和Cel12A-5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus cel12A 5′端mRNA序列；

(3)Aus cel12A 5′端启动子序列的克隆：以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和Cel12A-5R1为引物，反应条件为：94℃4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；第二轮PCR以T-PrimerF和Cel12A-5R2为引物，反应条件为：94℃，4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aus cel12A 5′端启动子序列；

(4)Aus cel12A 3′端转录终止区序列的克隆：基于上述得到的Aus cel12A 3′端mRNA序列，设计两条正向引物Cel12A-3F3和Cel12A-3F4；

Cel12A-3F3：5′-GTGTCAGAAAGCCCTATCAA-3′

Cel12A-3F4：5′-CAGCTATCTCACTCAGAACC-3′

以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以Cel12A-3F3和T-PrimerR为引物，第二轮PCR以Cel12A-3F4和T-PrimerR为引物；目的条带经克隆、测序，得到Auscel12A 3′端转录终止区序列；

4.Aus Cel12A工程菌的构建和表达方法：

(1)含编码Aus Cel12A成熟肽基因的表达质粒的构建：以M13 Primer M4和Cel12A-F为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃60s；72℃10min)；以Cel12A-F和Cel12A-R为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃45s；72℃10min)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-cel12A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-cel12A，并对重组质粒进行测序鉴定；

(2)GS115/cel12A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-cel12A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/cel12A；该工程菌用1.0％甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达240IU/mL。发酵液经离心后的上清液为重组β-内切葡聚糖酶粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组葡聚糖酶分子量为27kDa；该重组葡聚糖酶最适作用温度60℃，最适作用pH 5.0，该酶在pH 3.0～7.0、60℃以下稳定。