[发明专利]一种产PVA脱氢酶的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产PVA脱氢酶（polyvinyl alcohol dehydrogenase, EC1.1.99.23，简称PVADH）的基因工程菌及其构建方法，特别是一种高产PVA脱氢酶的基因工程菌及构建方法与应用，属于遗传工程领域。

背景技术

PVA（全称polyvinyl alcohol），即聚乙烯醇，是一种人工合成的水溶性的高分子化合物，具有如下优良理化特性：溶解性好：PVA溶于水，水温越高则溶解度越大，但几乎不溶于有机溶剂；成膜性强：PVA易成膜，其膜的机械性能优良，膜的拉伸强度随聚合度、醇解度升高而增强；粘接性好：PVA与亲水性的纤维素有很好的粘接力，一般情况，聚合度、醇解度越高，粘接强度越强；热稳定性好：PVA粉末加热到100℃左右时，外观逐渐发生变化。由于其特殊的理化性能，目前主要用于纺织行业浆料、织物整理剂、维尼纶纤维原料；建筑装潢行业的107胶、内外墙涂料、粘合剂；化工行业用作聚合乳化剂、分散剂及聚乙烯醇缩甲醛、缩乙醛、缩丁醛树脂；造纸行业用作纸品粘合剂；农业方面用于土壤改良剂、农药粘附增效剂和聚乙烯醇薄膜；还可用于日用化妆品及高频淬火剂等方面。

纺织工业中的浆料，以PVA为主要成分，纺织品经过上浆处理，其理化性能更好、手感更佳。但是，上浆工艺也带来了污染的问题，纺织品经过上浆后，还需要进行退浆处理，去除纺织品上未结合的PVA，传统的退浆过程是用高温加酸/碱或是用氧化剂来破坏PVA的长链结构使其降解, 但是化学方法会对织物纤维结构造成了较大的损伤，同时退浆废水的排放会对环境造成极大的污染，如果对污水进行处理，后续处理的费用高昂，又会增加企业的负担。

近年来人们寻求通过生物法降解PVA，提高了纺织品的质量，避免了化学法降解PVA对植物纤维造成的损伤。目前，国内外尝试通过PVA降解酶降解PVA。PVA降解酶是一个酶系，它们作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式报道的PVA降解酶主要包含三个种类： PVA脱氢酶(EC1.1.99.23) 、PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1.1.3.30)和氧化型PVA水解酶（β-双酮水解酶）(EC3.7.1.7)。目前对于PVA降解的研究主要集中在三个方面：1.筛选能够降解PVA的微生物；2.纯化PVA降解酶；3.克隆与PVA降解相关的基因。

    PVA脱氢酶 (EC1.1.99.23)以PQQ为电子受体的情况下，将PVA脱氢氧化为酮基化合物。目前，关于PVA脱氢酶基因的报道不多，1996年Shimao等人在大肠杆菌中用载体Puc18 构建了PVA降解菌Pseu domonas sp1 VM15C 的基因文库。编码PVA脱氢酶基因的蛋白有639 个氨基酸残基,发现有一个血红素结合位点和一个PQQ 结合位点,氨基酸序列表明与其它醌蛋白脱氢酶有较低的相似性（Shimao M et, Cloning and characterization of the gene encoding pyrroloquinoline quinonone- dependent poly (vinyl alcohol) dehydrogenase of Pseudomonas sp . st rain VM15C）；Mamoto根据纯化的PVA脱氢酶氨基酸的N端序列，克隆出PVA脱氢酶的全基因，全长1965bp，共655个氨基酸，重组酶与Pseu domonas sp1 VM15C产的PVA脱氢酶有51%的同源性，该酶除了能够降解PVA外，还能够降解二醇类，如聚丙烯醇、1.3-丁醇、2.4-戊二醇等，但该酶不能作用仲醇和叔醇。

目前，国外对PVA脱氢酶的研究主要侧重于其基因报道和降解机理上，关于PVA脱氢酶基因工程菌的研究报道很少，关于高产PVA脱氢酶基因工程菌的报道则更少。   

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种产PVA脱氢酶（polyvinyl alcohol dehydrogenase, EC1.1.99.23，简称PVADH）的酵母工程菌。

所述酵母工程菌染色体上携带有PVA脱氢酶的基因（PVADH）。

所述PVA脱氢酶核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

所述PVA脱氢酶基因位于表达载体pPIC9K上。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种PVA脱氢酶基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题提供如下具体步骤：

第一步 PVA脱氢酶基因设计