[发明专利]小鼠成纤维细胞Ⅲ型胶原的荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明设计一种检验技术领域的检测方法，具体是一种小鼠成纤维细胞III型胶原的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

成纤维细胞是动物体内结缔组织的主体细胞成分，其分泌的胶原纤维，弹性纤维及基质成分，与成纤维细胞一同构成了一些器官的主体结构，为器官中功能细胞提供生存的场所。一方面，正常皮肤以I型和III型胶原为主，在皮肤老化过程中，成纤维细胞数量逐渐减少，合成胶原蛋白和弹性蛋白能力下降，胶原含量逐渐降低。另一方面，在一些功能性器官如肝脏，在受到各种慢性损伤的愈合反应中，肝脏内成纤维细胞异常活跃，合成并分泌大量外基质，主要是I型和III胶原，降解则绝对或相对不足，从而使细胞外基质在肝脏内弥漫性沉积、形成肝纤维化。

经过对现有技术的大量文献检索后发现，目前检测III型胶原的方法主要是检测蛋白含量，另一个是利用逆转录聚合酶连是反应(RT-PCR)。但是这些方法耗时长，无法定量，结果无法反应基因表达改变的真实情况，从而无法为抗衰老物质的研究和抗纤维化新药研发提供准确的科学数据。荧光定量RT-PCR克服了传统PCR费时，无法定量与扩增后需要电泳检测等缺点，实现了对样品中单个细胞内III型前胶原基因含量的定量检测，具有简单易操作，结果直观，敏感性高，特异性强，重复性好等优点，已成为研究基因表达的重要方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种小鼠成纤维细胞III型胶原的荧光定量PCR检测方法。本发明的方法具有灵敏性高，稳定性高，可以定量，特异型好，假阳性低等特点。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明的方法包括如下步骤：

步骤一，以小鼠III型前胶原基因中的内含子序列SEQ ID NO：1为靶目标，设计引物；

步骤二，利用碱基序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段构建重组质粒；

步骤三，提取样品的RNA，逆转录得到cDNA；

步骤四，按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中的III型前胶原基因表达的含量。

优选地，步骤一中，所述引物为：上游引物：5’-CAGAGGCTTTGATGGACGCA-3’，下游引物：5’-TCTCCCTTCGCACCGTTCTT-3’。

优选地，步骤二中，所述重组载体使用的质粒是pET-32a。

优选地，步骤四中，所述荧光定量PCR检测方法中，PCR单个循环为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸40秒。

优选地，步骤四中，所述荧光定量PCR检测方法中，共32个PCR单个循环。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：与传统RT-PCR相比，本发明的方法具有灵敏性高，稳定性高，可以定量，特异型好，假阳性低等特点；本发明的方法可以同时进行大量样品的检测，具有高通量性；本发明的方法既可以检测体外培养组织或细胞的样品，也可以检测活体组织样品；与常规PCR相比，本发明的方法无需扩增后电泳分析，避免了PCR产物污染的风险，也避免了对操作人员接触有毒化学品的风险；本荧光定量PCR检测方法具有检测范围广的特点，在100～109拷贝范围内具有良好的线性关系，检测范围可以达到10个数量级。

附图说明

图1为实施例中III型前胶原基因绝对定量的标准曲线示意图；

图2为实施例中荧光定量PCR敏感性检测的荧光信号图；

图3为实施例中荧光定量PCR引物特异性检测的荧光信号图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版(科学出版社，2002)中所述的条件，或者按照各制造商所建议的条件。

实施例

1、设计引物

从基因数据库中检索获得小鼠III型前胶原的mRNA序列(Gene Bank登录号为NM_009930.2)，通过DNAstar软件进行序列比对，得到小鼠III型前胶原的特异性保守序列SEQ ID NO：1；

通过Primer5.0软件对该保守序列进行引物设计，得到一对特异性引物，目的扩增片段为531bp。

上游引物：5’-CAGAGGCTTTGATGGACGCA-3’；(SEQ ID NO：2)