[发明专利]一种β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn11C)基因的克隆及分析

说明书

技术领域

本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种新型β-1，4-内切木聚糖酶基因(Aus xyn11C)完整mRNA和DNA序列的克隆以及分析，属于生物工程技术领域。

背景技术

木聚糖是仅次于纤维素含量的第二丰富的可再生多糖，广泛存在于陆生植物细胞壁中，由于木聚糖在动物体内具有很强的抗营养作用，因而大大限制了大麦、小麦等禾谷类饲料在畜牧生产中的应用。木聚糖完全降解需要几种酶协同作用，其中β-1，4-内切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC3.2.1.8)最为关键，它以内切方式随机作用于木聚糖的主链，产生长度不同的木寡糖。木聚糖酶广泛存在于真核和原核微生物、以及某些动植物中，微生物β-1，4-D-内切木聚糖酶是由一条多肽组成，其分子量在8～145kDa之间，在pH值为3～10.5范围内较稳定，最适酶促反应pH值一般在4～7之间，最适酶促反应温度一般位于40～60℃之间。根据Henrissat(1993)的分类标准，木聚糖酶分别属于第11家族糖苷酶和第10家族糖苷酶。第10家族的木聚糖酶的结构、理化性质较相似，但第11家族的木聚糖酶在pI、pH值、热稳定性及酶分子的结构等方面相差较大。到目前为止，国内外已有300余种不同来源的木聚糖酶基因的报道，其中100多种基因被克隆和表达在合适的宿主中，但研究较多的是细菌来源的木聚糖酶基因，目前生产应用中的木聚糖酶主要来源于真菌，因为真菌产生的木聚糖酶多为胞外酶，易于纯化分离。

木聚糖酶在造纸、食品、饲料等工业以及能源和环境科学等领域具有潜在的应用价值。但微生物产木聚糖酶热稳定性不高。近年来，主要采用基因工程技术和蛋白质工程技术来改变木聚糖的性质。

发明内容

宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)来源的木聚糖酶具有良好的耐酸性。目前已经从A.usamii中克隆了第11家族的β-1，4-内切木聚糖酶A(Xyn11A)及β-1，4-内切木聚糖酶B(Xyn11B)，并在多种不同表达体系中进行了表达，一种新型内切β-1，4-木聚糖酶是A.usamii E001发现的第三种11家族的木聚糖酶，命名为Aus Xyn11C，其相应的基因命名为Aus xyn11C。本发明的目的是提供一种A.usamii E001新型内切β-1，4-木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列，并对该基因序列及其编码的氨基酸序列进行了详细的分析，为下一步表达载体的构建和遗传转化奠定了基础。

A.usamii E001菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol.31，No.4，Pg.50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。

本发明的技术方案：一种源自A.usamii E001的新型β-1，4-内切木聚糖酶(Aus Xyn11C)，其基因(Aus xyn11C)完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。获取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。

所述的由完整mRNA推导的Aus Xyn11C氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

所述的Aus xyn11C完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法：

(1)Aus xyn11C 3′端mRNA序列的克隆：首先对Aspergillus oryzae RIB40，Aspergillusflavus NRRL3357和Neosartorya fischeri NRRL181 β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的不同于Xyn11A和Xyn11B的保守序列；再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物Xyn11C-F1和Xyn11C-F2

Xyn11C-F1：5′-TTCCT(C/G)GC(T/C)GGAAAGGGCT-3′

Xyn11C-F2：5′-AC(T/C)GAGTGGTAC(G/A)TTGTCGA-3′

提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-xyn11C3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xyn11C3′端mRNA序列。