[发明专利]一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物，可用于轮枝菌群落结构的DGGE鉴定分析。

背景技术

轮枝菌(Verticillium)是自然界广泛存在的一类真菌，其中包括植物病原真菌和昆虫病原真菌。蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)是该属中极有益的一种真菌，包含种类非常丰富，可以感染多种作物上的病原真菌、害虫和病原线虫，已被证实是一种极具潜力的微生物杀虫剂，在欧美、前苏联等国成功应用于温室害虫的生物防治。蜡蚧轮枝菌在轮枝菌群落中的存活规律的阐明，将对指导其在害虫综合防治体系中的应用具有重要意义。昆虫病真菌传统研究方法主要依赖于选择性平板培养和虫饵诱集，然而尚无对蜡蚧轮枝菌敏感的选择性培养基和供试虫体，这严重制约了蜡蚧轮枝菌存活规律的研究。

变性梯度电泳(DGGE)技术由Fischer和Lerman于1979年最先提出，是用于检测DNA突变的一种电泳技术。Myers于1985年首次在DGGE中使用GC发夹技术，可防治DNA片段在DGGE胶中完全解链，DNA片段中每个碱基处的序列差异基本都能被区分开，使DGGE技术日臻完善。与传统的微生物研究方法相比，DGGE的一大优点是能够快速、准确的鉴定各种样品中微生物群落结构演替规律和种群动态，无需对所研究的微生物进行纯种培养。DGGE的另一优点是能够同时对比分析大量的样品，既可比对分析不同微生物群落间的差异，也可研究同一微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。因此，DGGE技术已成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具。

发明内容

本发明是为了解决目前缺乏引物用于轮枝菌群落结构DGGE分析的问题，而提供一种用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物。

本发明用于轮枝菌群落结构DGGE分析的引物为：正向引物S1(5’-TAACGGAGGGTTAGGGCTCGACC-3’)和反向引物A1-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGTACGAGCTTTTTAACCA-3’)。

本发明的引物是根据轮枝菌属真菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本发明的引物S1/A1-GC可扩增出长度为313bp的目的片段，通过DGGE分析PCR扩增产物可提供样品中轮枝菌群落结构的信息。

附图说明

图1为采用引物S1/A1-GC对样品的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图谱。M泳道为BM2000，1-4号泳道为样品PCR扩增产物，5号泳道为空白对照。

图2为采用引物S1/A1-GC对样品的PCR扩增产物的DGGE电泳图谱。

具体实施方式

土壤样品DNA提取：称取5g土壤样品和1g玻璃珠至50mL离心管，加入13.5mL DNA提取液(0.1mol/LTris base，0.1mol/LEDTA，0.1mol/L磷酸钠，1.5mol/LNaCl，1％CTAB，pH8.0)混合，加入100μL蛋白酶K(10mg/mL)，置摇床，225r/min，37℃摇30min；加入1.5mL SDS(20％)，置水浴锅，65℃水浴2h，每隔15～30min缓慢颠倒离心管数次；取出后室温，3000rpm离心5min，收集上清液至新的50mL离心管；土壤样品沉淀继续加4.5mL DNA提取液和0.5mL SDS(20％)，涡旋10s，置水浴锅，65℃水浴10min，收上清液，与前一次上清液合并，重复上述操作，收集上清液与前两次上清合并；上清液加入等体积氯仿-异戊醇(体积比为24∶1)，12000rpm离心5min；将水相转至50mL离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1h，室温16000rpm离心20min；收核酸沉淀，加入70％乙醇(冷)，洗涤沉淀两次，重悬于TE缓冲液，最终体积500μL。