[发明专利]葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗病基因启动子克隆，特别是涉及葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

植物在受到病原侵袭时，能够响应外界环境信号，通过一系列的信号转导途径传递到作用位点，进而做出防御应答，使寄主植物免受病原菌的侵害。植物对不同病原菌信号的反应机制各不相同，但信号分子均可将信号物质传递到转录因子并将其激活，通过转录因子与启动子特异的顺式作用元件相结合启动靶基因的转录表达，或者形成同源或异源二聚体，或者直接与蛋白质互作引起一系列的生理、生化反应，从而使植株表现出抗病性。在植物抗病应答过程中，涉及不同抗病信号转导途径中的多种基因，而植物抗病相关的转录因子调节植物获得抗性的过程中起着枢纽作用。

锌指蛋白普遍存在于植物中，其中还有一些是植物中特有。目前已经在拟南芥、矮牵牛、小麦、棉花、大豆以及水稻等植物中克隆了一些锌指蛋白。根据锌指蛋白的结构特征或功能差异，又可以分为TF111A蛋白、WRKY蛋白、GALA蛋白、PHD蛋白、DOF蛋白、RING蛋白等亚家族。环锌指(RING)为一类特殊的锌指蛋白，组成了很大的一个基因家族，广泛存在于动物，植物，微生物。在植物中，对环锌指家族基因进行的研究仅限于模式植物拟南芥，对于栽培作物研究较少，尤其在果树上研究更少。已有的研究结果表明，大部分环锌指家族基因具有泛素连接酶的活性，在泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径中起识别底物的关键作用。环锌指型泛素连接酶在植物胚胎发育、激素响应、光形态建成，逆境胁迫中扮演着重要的角色，最近研究结果表明其在植物抗病反应过程中起重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列及其通过转基因技术提高农作物的抗病能力。在克隆得到葡萄抗病基因VpRFP1的基础上，进一步通过染色体步移技术获得抗病基因VpRFP1的启动子序列，并通过启动子功能分析验证VpRFP1基因启动子的功能。

采用CTAB法提取葡萄基因组DNA，酶切基因组后纯化、连接接头，建立葡萄基因组步移文库，以文库库液作为聚合酶链式反应(PCR)反应模板，利用巢式PCR反应克隆VpRFP1的启动子序列，PCR产物经回收、连接至克隆载体，转化后筛选阳性克隆，测序分析后获得启动子序列1249bp；

将VpRFP1启动子序列克隆至瞬时表达载体，瞬时转化烟草，并进行生物或非生物胁迫处理，随后进行化学组织染色和β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶(GUS)荧光定量分析葡萄VpRFP1启动子对各种逆境的反应。

本发明对葡萄接种白粉病原菌诱导抗病相关基因的表达，构建了cDNA文库获得107条表达序列标签，其中一条表达序列标签具有环锌指保守结构域，通过基因功能分析表明该基因具有抗病功能，基因的表达是由基因的启动子控制，进一步克隆了该环锌指基因的启动子序列并分析了其启动子功能。

附图说明

附图1为本发明巢式PCR扩增中国野生华东葡萄白河-35-1株系VpRFP1的启动子电泳图。

M：DL2000 Maker；1：EcoR I库/2轮PCR；2：Xba I库/2轮PCR。

附图2为本发明VpRFP1基因启动子瞬时表达载体构建示意图。

P₀GUS：GUS基因前不含启动子，作为阴性对照；P_35SGUS：CaMV 35S启动子连接在GUS基因前，作为阳性对照；P_VpRFP1GUS：VpRFP1基因启动子连接在GUS基因前；P_R-VpRFP1GUS：VpRFP1基因启动子反向连接在GUS基因前。

附图3为本发明VpRFP1基因启动子瞬时表达载体构建电泳检测图。

(A)BamH I与Pst I双酶切pCAMBIA1380载体，M：DL2000Marker，1：pCAMBIA1380载体，2：pCAMBIA1380载体双酶切；

(B)BamH I与PSt I双酶切pMD-19T/P_VpRFP1，pMD-19T/P_R-VpRFP重组载体，M：DL2000Marker，1：pMD-19T/P_VpRFP1重组载体，2：pMD-19T/P_VpRFP1重组载体双酶切，3：pMD-19T/P_R-VpRFP重组载体，pMD-19T/P_R-VpRFP重组载体双酶切；