[发明专利]猪ERp44基因启动子区转录调控元件

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种猪ERp44基因启动子区的转录调控元件的克隆及功能验证。

背景技术

内质网蛋白44(ERp44)参与调节细胞内分泌蛋白的正确合成与分泌。ERp44可滞留细胞内的ERO1，影响PDI氧化形成二硫键。此外，ERp44还能与免疫球蛋白M亚基、脂联素和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)形成二硫键，从而调节其分泌和转运。ERp44在蛋白质的滞留和内质网内的成熟控制中发挥重要作用，它能与IP₃R₁结合，调节其在内质网内的加工和Ca²⁺浓度依赖的分泌调节(Higo et al.，2005)。脂联素是由脂肪组织特异分泌的可调节胰岛素敏感性和能量代谢平衡的重要脂肪细胞因子。体内循环系统中的脂联素以高分子量、低分子量和三聚体等三种主要的形式存在(Sun et al.，2009)。最近的研究发现，ERp44、ERO1-Lα和GGA能调控脂联素的合成与分泌，而PPARγ激动剂能增加脂联素的分泌(Wang et al.，2007)，这表明ERp44基因可能受到PPARγ的转录调控，但其分子机制尚不明确。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷。提供一种猪ERp44基因(GenBank注册号：NM_001137629)5’上游转录调控区域，确定猪ERp44基因的启动子区转录调控元件，对研究ERp44在脂肪细胞中的表达调控机制及其与脂联素分泌调节的关联具有重要意义，有助于从分子水平阐明脂联素的系统生理功能，为治疗肥胖和胰岛素抵抗提供相关理论基础。

本发明的另一个目的在于提供含有上述基因启动子区转录调控元件的载体。

实现本发明的技术方案如下：

申请人通过克隆技术，从猪基因组获得内质网蛋白ERp44基因启动子转录调控区域，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示的1～1562位(即猪ERp44基因的-1562～-1位)。

为了获得本发明的ERp44基因的表达调控元件，对猪ERp44基因的启动子区的5’端逐步缺失，插入到pGL3-Basic载体，得到一系列表达质粒，利用萤火虫荧光素酶报告基因检测这些质粒在猪肾细胞系IBRS2和小鼠成纤维细胞系NIH/3T3中的转录活性。结果显示，在序列表SEQ ID NO：1所示序列的246～1091位为主要转录活性调控区域(即猪ERp44基因的-1317～-472位)。

对SEQ ID NO：1所示序列的246-1091位为主要转录活性调控区域的序列分析显示：该取段序列中包含一个PPRE位点，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示的559～582位的DNA片段(即猪ERp44基因的-1004～-981位)。本发明针对该PPRE位点进行了删除或突变，检测其对ERp44基因转录活性的影响。结果显示，上述PPRE位点是PPARγ调控ERp44基因表达的关键调控元件，PPARγ可与该位点结合抑制ERp44基因的转录，从而促进脂联素的分泌。

本发明首次鉴定了猪ERp44基因启动子关键调控元件，对于研究ERp44基因的表达调控机制和脂联素分泌调节具有重要意义。

附图说明

图1为猪ERp44基因启动子5’逐步缺失质粒在NIH/3T3和IBRS2细胞内的荧光素酶活性分析。图1中：(A)为猪ERp44基因启动子不同截短的结构示意图；(B)为猪ERp44基因启动子不同截短的活性分析。荧光素酶载体瞬时转染到NIH/3T3和IBRS2细胞内，pGL3-Basic作为对照，含有CMV启动子的海肾荧光素酶报告质粒作为内参，反应转染的效率；(C)为不同物种ERp44基因启动子内保守的PPRE位点分析。结果显示，-1317～-472位的启动子截短载体具有最大的启动子活性，而这一个区域正好含有推测的在多物种中高度保守的PPRE结合位点(-1004～-981)，说明PPARγ可能在调节ERp44的转录活性中起作用。

图2为PPRE位点缺失时PPARγ对猪ERp44基因启动子活性的影响。