[发明专利]一种糖苷酶催化与盐析萃取偶联制备天然药物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种盐析萃取与糖苷酶水解反应偶联制备药物或药物中间体的方法。

背景技术

天然产物逐渐成为医药、食品及饲料的重要来源，以天然产物为主的保健食品和药物目前具有相当大的市场。糖苷类天然产物在众多天然产物中占有重要地位，一系列具有生物活性及药用价值的糖苷相继投入使用，如天麻苷、熊果苷、洋地黄苷、桔梗皂苷、人参皂苷等。苷类的活性常与糖基的类型和数量相关，糖基的改变可引起活性的变化，许多苷元都具有比糖苷更强的生物活性，因此糖苷水解研究受到人们的普遍关注。相比于化学(酸或碱)水解，生物或酶催化水解具有选择性高、条件温和、活性保留率高、环境污染小等特点，因而近年来研究开发的报道也比较多。例如，沈玥等利用乳酸菌β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮，制备大豆异黄酮苷元(中国油脂，2009，34(9)：60-63)；伍毅等利用固定化β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷制备黄酮苷元(哈尔滨工程大学学报，2009，30(5)：584-588)；杨轶舜等利用固定化β-葡萄糖苷酶转化京尼平苷制备京尼平(华东理工硕士学位论文，2009)；胡英杰等用蜗牛酶水解牛蒡子苷制备苷元(广州中医药大学学报，2004，21(6)：473-475)；韩凤梅等用纤维素酶对盾叶薯蓣进行预处理，提高薯蓣皂苷元得率(化学与生物工程，2004，6：26-27)；，李梦青等用纤维素酶把虎杖中的白藜芦醇苷转化成白藜芦醇(精细化工，2008，25(5)：467-470)，等等。

由于糖苷类天然产物大多数水溶性较差，反应体系中的底物浓度较低，因此生物或酶催化水解的效率比较低。不少学者开展了一些研究试图解决上述问题，结果表明有些有机溶剂能够增加糖苷的溶解度，提高酶催化反应的速度。如詹秀文发现四氢呋喃(≤8％)、二甲基亚砜(≤18％)、含2％四氢呋喃的二甲基亚砜(≤15％)、含10％二甲基亚砜的四氢呋喃(≤8％)对猪胰脂肪酶都有激活作用(华南农业大学硕士学位论文，2008)。尽管有机相酶催化反应速度得到提高，但是随着产物的不断积累，酶的活性往往受到高浓度产物的抑制，尤其是水解下来的单糖对酶的活性有明显的抑制作用，严重影响反应速度和转化率。如郁惠蕾等研究表明高浓度的单糖可使糖苷水解酶催化的糖苷水解反应向逆方向进行(有机化学，2006，26(6)：1052-1058)。如果能将产物及时移走，那么无疑将解除产物对酶的抑制作用，进一步提高反应速度。

萃取与发酵或酶催化反应耦合，实现边反应边分离，这是近几年研究的热点，但在糖苷酶催化的水解反应方面尚无文献报道。盐析萃取近年来在天然产物分离方面有一些成功的尝试，如利用亲水性的低分子有机物与无机盐溶液形成的新型双水相将极性较强的有效成分富集在上相，或者用无机盐溶液、亲水性的低分子有机物以及疏水性有机物形成的三液相体系分离不同极性的有效成分(中国专利：CN101637667)。将糖苷酶催化与盐析萃取分离偶联还需要解决酶在有机相中的稳定性问题，考察底物、产物、酶的分配与匹配，达到提高底物溶解度，解除产物抑制，提高酶催化效率的目的。本发明的目的就在于开发一种新的、易于产业化的反应分离耦合的方法，提高生产效率，降低生产成本。

发明内容

为解决天然活性成分在酶催化转化与提取分离过程中存在的诸多问题，如有效成分在水相中溶解度低，产物积累抑制酶催化活性，有效成分转化后产物分离步骤繁琐等，本发明提供了一种糖苷酶催化与盐析萃取偶联制备天然药物或中间体的方法。

本发明采用的技术方案包括如下步骤：

将酶催化转化的底物溶解于亲水性有机溶剂中，加入可溶性无机盐，静置分成上下两相，然后将糖苷酶加入上相，进行转化反应。水解下的单糖分配于下相(无机盐相)，上相是富含目标产物的萃取液；或者向两相系统中加入疏水性有机溶剂，形成三液相，然后将糖苷酶加入中间相，反应产生的单糖分配于无机盐相，目标产物富集于上相，未反应的底物和酶则保留在中间相。

糖苷酶催化转化的底物为糖苷类单体化合物(甾体和萜类皂苷、蒽醌萜类以及环烯醚类皂苷)或含此类成分的药材粉末、提取物，单体化合物如盾叶新苷、三角叶皂苷、薯蓣皂苷元-葡萄糖三糖苷、薯蓣皂苷元-葡萄糖二糖苷、延玲草次苷、白藜芦醇苷、京尼平苷、人参皂苷Re、Rg1、Rd、Rc、甘草酸、大豆皂苷I、II、IV等，药材如盾叶薯蓣、虎杖、栀子、人参、甘草、大豆等中药材。目标产物为糖基数目少于转化底物的药物或药物中间体，如薯蓣皂苷元、白藜芦醇、京尼平、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷CK、单葡萄糖醛酸-甘草次酸、大豆甾醇B等。