[发明专利]一种重组多功能纤维素酶的生产方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用银耳芽孢工程菌株生产多功能纤维素酶的方法。 利用甘蔗渣高效生产重组多功能纤维素酶的方法。

背景技术

纤维素、半纤维素是自然界最丰富的可再生资源之一，是植物细胞壁的主要组成物质。地球每年由光合作用产生数亿吨的植物干物质（多糖类物质），其主要成分就是纤维素和半纤维素。纤维素和半纤维素的酶学降解又是目前公认的最有效、最清洁的转化方法。其生物降解需要纤维素酶的作用。而纤维素酶是一种复合酶系，主要包括内切-β-1,4-D-葡聚糖酶（E.C. 3.2.1.4）、外切-β-1,4-D-葡聚糖酶（E.C. 3.2.9.11）和β-葡萄糖苷酶（E.C. 3.2.1.21）。纤维素的降解需要这些酶的协同作用才能完成，单一酶组分对纤维素的降解能力很差。多功能纤维素酶（MFC）同时具有内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和内切-β-1,4-木聚糖酶3种酶活性，能高效分解天然纤维素。

目前生产纤维素酶的主要生产菌株有木霉、青霉和曲酶，生产方法是通过对这些丝状真菌的固体发酵或液体发酵获得纤维素酶，由于这些丝状真菌所产生的纤维素酶成分单一，在实际应用中酶的活力较低，不能有效地降解纤维素（如上所述纤维素的降解需要多种酶的协同作用才能完成），而且目前纤维素酶的生产工艺复杂、生产成本高。本发明的银耳芽孢工程菌株生产的多功能纤维素酶同时具有内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和内切-β-1,4-木聚糖酶3种酶活性，能高效地降解纤维素。而且银耳芽孢工程菌株的启动子为组成型启动子，不受其他诱导物的影响，生产性能稳定。同时，本发明使用的培养基为农业废弃物甘蔗渣，生产成本低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用银耳芽孢工程菌株高效生产重组多功能纤维素的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种重组多功能纤维素酶的生产方法，多功能纤维素酶基因转化银耳芽孢获得银耳芽孢工程菌株，作为生产菌株，以甘蔗渣粉为主要原料作为培养基，摇瓶发酵生产重组多功能纤维素酶。

所述培养基的配方为：甘蔗渣粉（20目）17-23g/L，酵母膏3.1-4.9 g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.46g/L，硫酸镁1g/L，pH值5.0-5.5；摇瓶发酵的条件是发酵温度23-25℃、发酵时间3-4d、转速165-190r/min。最佳培养条件为：培养温度25℃、培养时间4d、摇床转速180r/min。

所述的银耳芽孢工程菌株菌种龄60-72h，菌株在培养基中的接种量为1-5%，即每100mL的培养基中接种1-5mL的银耳芽孢菌种，其芽孢浓度的OD₆₀₀值为1.5-1.9。该银耳芽孢工程菌株是多功能纤维素酶基因转化银耳芽孢获得的，其制备方法可参见赵淑娴硕士论文（多功能纤维素酶基因mfc遗传转化银耳芽孢的研究，华南农业大学硕士论文，2008年6月）。

可以采用以下优选方案进行发酵生产：

（1）将所述银耳芽孢工程菌株接种于PDSA固体培养基上，25℃培养4～5d，挑取单菌落接种于100mL PDSB液体培养基中，25℃，180r/min振荡培养72h；

（2）配制甘蔗渣培养基，甘蔗渣粉（20目）17-23g/L，酵母膏3.1-4.9 g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.46g/L，硫酸镁1g/L，pH值5.0-5.5，分装于250mL三角瓶中，每瓶装液量100mL，高压灭菌；

（3）在超净工作中每瓶接种1mL步骤（1）中培养的菌种，接种后置于25℃下摇床培养，摇床转速165-190r/min。

（4）培养4d后终止培养，离心收集发酵液。

其中的PDSA固体培养基配方为以下重量份数的物质构成：马铃薯200份、葡萄糖20份、磷酸氢二钾3份、硫酸镁1.5份、葡萄糖20份、琼脂20份，水补充至总重量1000份。PDSA液体培养基配方为以下重量份数的物质构成：马铃薯200份、葡萄糖20份、磷酸氢二钾3份、硫酸镁1.5份、葡萄糖20份，水补充至总重量1000份。

本发明是通过单因素筛选、PB设计及响应面实验的方法获得了银耳芽孢工程菌株高效生产重组多功能纤维素的最佳培养基配方及最佳培养条件。不仅为重组多功能纤维素酶的高效生产提供了一种有效的方法，而且也为农业废弃物的合理利用提供科学理论依据。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：