[发明专利]一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法

权利要求书

1.一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

（1）土壤胞内蛋白质提取：

取0.8-1.5g土壤，加入0.05mol/L，pH8.0的柠檬酸钠缓冲液4-6mL，于漩涡振荡器中振荡2.5-4小时，15000rpm离心25min，弃上清液；取沉淀，加入0.05mol/L，pH8.0柠檬酸钠缓冲液4-6mL并于漩涡振荡器中振荡10-20min，然后15000rpm离心25min，弃上清液，重复2次；取沉淀，加入SDS缓冲液4-6mL，于漩涡振荡器中振荡50-80min；振荡结束后，15000rpm离心25min，收集上清液，并过0.45μm的微孔滤膜，取滤液添加pH为8.0的Tris-饱和酚2-3mL，置于漩涡振荡器中振荡25-40min，静置20-50min，然后15000rpm离心25min，取下层酚相，加入5倍体积预冷至4^oC的0.1mol/L甲醇-醋酸铵溶液，置于-20^oC条件下沉淀、过夜，然后15000rpm离心25min；弃上清液，沉淀中加入甲醇洗涤，15000rpm离心25min，去除甲醇上清液，用丙酮洗涤沉淀，15000rpm离心25min，去上清液，重复1～2次；取沉淀，将沉淀于超净台中吹干，获得蛋白质干粉；

（2）土壤胞内蛋白质分离：

取1.2mg蛋白质干粉，加入300μL蛋白质裂解液，制成蛋白质样品，进行双向电泳分离。

2.根据权利要求1所述的一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，其特征在于：步骤（2）所述双向电泳的具体步骤为：选取24cm IPG胶条，加入蛋白质样品后置于水化盘上水化12-24小时，然后放入IPGphor等电聚焦仪中，等电聚焦仪电泳参数为500V，1小时、1000V，6小时、8000V，7小时、3000V，10-30小时；等电聚焦结束后，将胶条分别置于平衡缓冲液Ⅰ和平衡缓冲液Ⅱ中，各平衡15分钟后进行SDS-PAGE电泳；SDS-PAGE电泳凝胶底层为12%分离胶，用0.8-1%的琼脂糖溶液封住胶条表面，以15mA恒定电流进行电泳，电泳温度保持在15-20^oC，电泳时间为7-9小时；电泳结束后，卸下胶片，胶片经固定、水洗、染色、脱色，最后用扫描仪扫描。

3.根据权利要求1所述的一种土壤胞内蛋白质的提取分离方法，其特征在于：

柠檬酸钠缓冲液的配置方法：称取1.4705g 2水合柠檬酸钠采用双蒸水溶解并定溶至100mL，并用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值为8.0；

SDS凝胶缓冲液的配置方法：首先称取0.121g Tris定容到1mL，加入浓HCL调pH值到6.8，其次加入0.25g SDS，0.31g 二硫苏糖醇，2mL甘油，0.02g溴酚蓝加水定容至10ml。