[发明专利]玉米愈伤组织特异性启动子及其克隆方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物启动子、其克隆方法及其应用，特别是涉及一种玉米愈伤组织特异性启动子、其克隆方法及其在培育安全性转基因植物中的应用。 

背景技术

筛选标记基因在植物基因工程中具有重要作用，利用筛选标记基因可以在植物转基因过程中从大量未转化的细胞中筛选出转化细胞。然而，转基因植物中的筛选基因又引起了人们对一系列生物安全方面的担心，如选择标记基因是否编码有毒的物质和过敏源，是否不利于植物代谢的改变，是否会降低治疗性药物的疗效，以及是否会在相近的物种和病原体间迁移等。如何从转基因植物中剔除筛选标记基因已经成为人们关心的问题。目前，主要有两种具有潜在的应用价值的剔除筛选标记基因的技术：一种是目的基因和筛选标记基因共转化技术，它可以使目的基因和筛选标记基因通过基因自由分离的原则在后代中剔除筛选标记基因而保留目的基因；另一种是通过位点特异性重组来剪除筛选标记基因的技术；此外，还有转座子介导的筛选标记基因剔除技术和同源重组介导的筛选标记基因剔除技术等。但上述从基因水平上剔除筛选标记基因具有繁琐复杂，转化周期长的缺点。 

发明内容

本发明提供了一种在玉米愈伤组织中特异性表达的启动子。本发明所提供的玉米愈伤组织特异性启动子，名称为ZMW，来源于玉米属玉米（Zea mays L.）。该启动子大小2880bp。 

本发明所涉及的设计方案为，一种玉米愈伤组织特异性启动子，通过生物信息学的方法初步确定，在玉米B73自交系中扩增该启动子，通过在水稻中验证在愈伤中特异性表达的启动子，具有序列表中<400>1下的序列。 

一种上述玉米愈伤组织特异性启动子的克隆方法，利用生物信息学筛选候选基因，然后与基因组序列进行比对分析，设计引物，上游引物：5’- CCG AAG CTT ATG ACA AGA GAA GTT GGA CAA G -3’，下游引物：5’- GCG AGA TCT TCA GAT CGA CCT CCT AGC TCT A -3’扩增该基因上游5’区域DNA序列，然后与GUS基因连接，通过转基因水稻验证启动子功能。 

根据上述玉米愈伤组织特异性启动子在植物愈伤组织基因功能研究和基因表达调控中的应用。 

本发明提供的一个玉米愈伤组织特异性启动子ZMW在水稻的愈伤组织中特异表达，能指导外源基因在植物发育过程中特定时空的表达，用该方法筛选转基因水稻具有阶段性强、灵敏度高的优点，而且由于筛选基因只会在愈伤阶段表达，在其他时期不会表达，它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物营养的不必要浪费，具有较大的实际应用价值。 

附图说明

图1为转基因植株的GUS染色结果（该启动子特异性的在愈伤组织中呈蓝色）。 

A为愈伤；B为根；C为叶；D为花粉；E为茎；F为颖壳；G为未成熟的种子；H为成熟的种子；I为子房。 

染色结果显示GUS基因在愈伤中特异性表达，其他部位均不表达，A图中的蓝色部分即为染上部位。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由Invitrogen公司进行，PCR试剂盒、连接试剂盒和载体构建过程中的核酸内切酶均购自于自宝生物工程有限公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司，方法均参照试剂盒说明书进行。 

一、玉米愈伤组织特异性表达的基因wrky的获得 

首先在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中以关键词“wrky”搜索基因,获得拟南芥wrky基因的蛋白序列。建立玉米蛋白本地数据库，使用“DNATOOLS 6.0”软件对获得的拟南芥wrky基因的蛋白序列进行BlastP（E-value=0.001）序列比对，筛选出同源性最高的玉米候选蛋白序列。接着使用“DNATOOLS 6.0”软件对获得的玉米全基因组DNA序列数据建立本地数据库，以获得的玉米蛋白序列进行BlastN（E-value=0.001）序列比对，筛选出同源性最高的候选基因。

对转基因植株进行GUS组织染色，但在拟南芥的愈伤中检测到GUS的表达，推测GUS可能在水稻的愈伤中表达。 

二、玉米愈伤组织特异性启动子wrky的克隆