[发明专利]一种检测氢化可的松的方法及其专用酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测氢化可的松的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

氢化可的松是一种肾上腺糖皮质激素类药物，主要作为人畜抗炎症、抗过敏、抗休克药，在饲料中使用能起到治疗治病、促动物生长作用，对动物的增重效果明显，但其残留可引起类肾上腺皮质亢进综合症、心血管、消化系统并发症及骨质疏松、肌肉萎缩等，严重威胁人们的身体健康。欧盟、美国、日本均规定了牛奶中最大残留限量为10μg/kg。

目前国内外检测氢化可的松类药物的检测方法主要有荧光光度法、反光光度法、高效液相色谱法、气相色谱质谱法等这几种方法，由于仪器设备的复杂和操作过程繁琐，对人员要求较高，不适合现场监控和大量样本筛查。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测氢化可的松的酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测氢化可的松的酶联免疫试剂盒，包括氢化可的松特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为氢化可的松半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标氢化可的松半抗原；当所述包被原为氢化可的松半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标氢化可的松半抗原；所述氢化可的松特异性抗体为氢化可的松的单克隆抗体或氢化可的松的多克隆抗体。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还可包括氢化可的松标准溶液、显色液、浓缩洗涤液、终止液、浓缩复溶液。

所述浓缩洗涤液为pH值为7.0-7.4，含有1.5-2.5％(质量百分含量)吐温-20和0.01-0.03‰(质量百分含量)硫柳汞防腐剂，0.02-0.04mol/L的磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液为pH值为7.2-7.6，含有2-4％(质量百分含量)牛血清白蛋白、0.02-0.04mol/L的磷酸盐缓冲液；所述显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液可以为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液可以为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液可以为1～2mol/L硫酸或盐酸溶液。

所述浓缩洗涤液具体可以为pH值为7.2，含有1.8％(质量百分含量)吐温-20和0.02‰(质量百分含量)硫柳汞防腐剂，0.04mol/L磷酸盐缓冲液；所述浓缩复溶液具体可以为pH值为7.4，含有4％(质量百分含量)牛血清白蛋白、0.03mol/L的磷酸盐缓冲液；所述显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液具体可以为过氧化脲，显色液B液具体可以为四甲基联苯胺；所述终止液具体可以为2mol/L盐酸溶液。

在洗涤液中加入一定量吐温-20和叠氮化钠的作用在于：缓冲液中吐温-20会减少抗体的非特异性吸附，还能对蛋白起到一定的保护作用，加入叠氮化钠后，则硫柳汞在溶液中抑制细菌的生长，对溶液的稳定性其到一个保护作用。

所述包被缓冲液具体可以为pH值为9.0-9.6的0.1-0.2mol/L的碳酸盐冲液；所述封闭液是含有0.5-1.0％(质量百分含量)卵清蛋白、0.1-0.2％(质量百分含量)吐温-20和2-3％奶粉的pH值为7.4-7.8的0.02-0.03mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述氢化可的松半抗原可以按照如下方法得到：氢化可的松和琥珀酸酐混合后，加入无水吡啶溶解，加热回流24h，旋蒸，除去吡啶，冷却，加入乙酸乙酯，用稀盐酸调节PH值，有机相用稀盐酸萃取，弃去水相，将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，除去干燥剂，旋蒸浓缩至1ml，用乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1做展开剂，过柱分离，得到氢化可的松半抗原。

所述氢化可的松特异性抗体是用所述氢化可的松半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述载体蛋白为甲状腺蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血蓝蛋白、纤维蛋白原或卵清蛋白。

氢化可的松是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本发明采用混合酸酐法将氢化可的松与载体蛋白偶联，突出了氢化可的松的特征结构，同时也增加了氢化可的松半抗原的免疫源性和特异性。其中，氢化可的松半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与载体蛋白(如卵清蛋白)的结合摩尔比为(12-16)∶1。

所述氢化可的松多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体。

所述氢化可的松单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No.4412的对氢化可的松单克隆抗体杂交瘤细胞株D-1-2分泌的抗体。