[发明专利]一种海带孢子体DNA的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及海带孢子体DNA的制备，具体地说是一种有效去除褐藻多糖的海带孢子体DNA的制备方法。

背景技术

海带是我国重要的经济海藻之一，它含有丰富的碘、蛋白质及各种人体必需的矿物元素。除了食用和药用价值外，海带所产生的褐藻酸和甘露醇是经济价值很高的工业原料。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，分子生物学技术已应用到海带的遗传与变异、种质鉴定及系统发育等方面的研究中，而进行分子生物学研究的前提条件是制备高纯度的海带孢子体总DNA。

众所周知，褐藻多糖如半乳糖及其衍生物和褐藻酸等一直是制约褐藻DNA制备的一个主要因素。与高等植物褐藻多糖相比，褐藻孢子体内的褐藻多糖含量高，粘性大且是水溶性的。由于褐藻多糖能够吸附DNA并与DNA共沉淀，导致所制备的DNA产量低，纯度差，进而导致后续常规的分子生物学操作无法进行，如限制性内切酶反应，PCR反应等。因此，制备高纯度，得率高的海带孢子体DNA是进行分子生物学研究的基础。

目前，关于褐藻DNA制备方法的已有一些报道。一是利用超速离心来去除褐藻多糖以纯化DNA，但这种方法需要大量的海带孢子体材料。二是利用Sepharose spin柱的方法来去除海带孢子体中的褐藻多糖。三是运用CTAB方法，在Sargassum polycystum和S.siliquosum的DNA制备中有效地去除褐藻多糖，以此DNA为模板，成功地进行了PCR反应。四是将褐藻酸裂解酶和CTAB结合来去除褐藻多糖。首先是用褐藻酸裂解酶裂解海带孢子体组织细胞，去除海带孢子体组织表面及细胞壁外褐藻多糖，再利用CTAB方法去除细胞内剩余的褐藻多糖。上述制备海带孢子体DNA的方法，过程繁琐，既费时费用又很高，而且褐藻多糖去除的不是很彻底。

发明内容

本发明提供了一种海带孢子体DNA的制备方法，可以解决现有技术存在的褐藻多糖去除不够彻底、过程繁琐、既费时费用又高的问题。

本发明的目的在于提供一个简单易行的、适用于实验室常规制备海带孢子体DNA的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种海带孢子体DNA的制备方法，包括如下步骤：

1)取海带孢子体在清水中反复清洗，以去除海带孢子体表面的杂质，并在液氮中迅速将海带孢子体研成藻粉粉末，研磨1-6次；液氮研磨使海带孢子体组织细胞破碎，释放细胞内DNA；

2)将上述藻粉粉末转65℃预热的SDS提取缓冲液中，63-65℃水浴保温60min；

3)加入占上述溶液1/3体积的KAc溶液，混合均匀，第一次去除褐藻多糖；KAc溶液浓度为5mol L^-1，pH 7.5；

4)离心，取上清，加入异丙醇；离心条件：室温10000rpm(10621×g)离心30min，取上清，加入等体积异丙醇沉淀DNA；

5)离心，弃上清，加入CTAB提取缓冲液使DNA进一步溶解，65℃保温15min，第二次去除褐藻多糖；离心条件：室温12000rpm离心10min；

6)离心(离心条件：室温12000rpm离心10min)，水相加入两倍体积的KAc溶液，离心(室温10000rpm离心20min)，第三次去除褐藻多糖；

7)加入上述溶液等体积的氯仿与异戊醇混合液，去除蛋白质等杂质；

8)离心，(离心条件：室温12000rpm离心10min)，水相用冷的异丙醇于-18至-20℃沉淀；

9)离心，用70％冷乙醇(重量百分比浓度)洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，终浓度为0.1μg μL^-1，以消化RNA，得终产品海带孢子体DNA；离心条件：室温12000rpm离心15min。

本发明通过三次去除褐藻多糖，并且CTAB提取缓冲液和KAc溶液配合使用，使得褐藻多糖去除的更彻底，并且操作简单，省时省力。

进一步地，所述步骤1)中于液氮中研磨时，液氮中加入10％海带孢子体重量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

进一步地，所述SDS提取缓冲液的组成为：2.0％sodium dodecylsulfate(SDS)，50mmol L^-1 ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，100mmol L^-1 Tris.HCl，pH 8.0，500mmol L^-1 NaCl，2％β-巯基乙醇。