[发明专利]一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、及其应用、大量制备豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。

背景技术

豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor，CPTI)是一种属于Bowman-Birk家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以与农业害虫(主要是鳞翅目、直翅目、鞘翅目昆虫)消化道中的丝氨酸蛋白酶形成酶-抑制剂的复合物，从而减弱或阻断蛋白酶的消化水解作用，进而使害虫产生营养不良，出现机能紊乱甚至死亡现象。与传统的Bt蛋白相比，CPTI蛋白具有抑虫或杀虫谱更广、对人畜安全等优点，是一种生物农药的潜在开发对象，因而在农林业具有很高的应用和推广价值。

大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的原核表达体系，主要由表达载体和宿主菌两部分组成。表达载体一般具有以下特征：稳定的遗传复制、传代能力；具有筛选标记；可调控的启动子，抑制时本底转录水平较低；具备外源基因插入的多克隆位点。宿主菌一般选择蛋白酶缺陷的菌株，如经典的BL21系列菌株就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。

但是并非所有外源基因在大肠杆菌表达系统中都能高效表达，本发明的发明人发现从豇豆中克隆得到的豇豆胰蛋白酶抑制剂不能在大肠杆菌中高效表达，其表达量较低，表达的蛋白活性较低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。

本发明的再一目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂。

本发明的另一目的是提供一种豇豆胰蛋白酶抑制剂原核表达载体。

本发明的另一目的是提供一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的方法。

本发明的另一目的是提供一种高效、大量表达豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因工程菌株。

本发明的另一目的是提供上述豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的应用。

如上所述本发明的发明人首先利用PCR反应从豇豆基因组DNA中直接获得CPTI基因(CPTI基因不含有内含子)，CPTI基因的开放阅读框编码106个氨基酸，该编码蛋白N端带有一个18个氨基酸的信号肽(SignalP：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。将该基因在大肠杆菌中表达，发现其表达量较低，表达的蛋白活性较低。

由于原核表达体系通常不具有识别真核细胞信号肽并将该蛋白成功定位的功能，而成熟有活性的蛋白总是在信号肽酶切除信号肽后才能形成，同时信号肽主要含疏水性氨基酸，在原核表达体系中大量表达时常常形成包涵体。因此，本发明的发明人在表达上述CPTI基因时去除了部分信号肽序列，同时优化了序列按照尽可能的去掉信号肽序列、又要保证不破坏蛋白的二级结构的原则，把基因前30个脱氧核糖核苷酸去除，利于在大肠杆菌中表达出该基因的重组蛋白。然后将改造优化的CPTI基因的编码序列构建到原核表达载体PGEX-6p-1中；随后将构建好的CPTI表达载体转化到表达菌株BL21(DE3)中，用诱导剂IPTG(isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)诱导融合蛋白的表达；利用融合蛋白的GST标签可以与Glutathione Sephrose 4B亲和的特性，可以纯化得到纯度达到90％以上的融合蛋白GST-CPTI。

优化后CPTI基因的序列如SEQ ID No.1所示：

cttgtagggg ttactactgc agccatggat ctgaaccacc tcggaagtaa tcatcatgat     60

gactcaagcg atgaaccttc tgagtcttca gaaccatgct gcgattcatg catctgcact    120

aaatcaatac ctcctcaatg ccattgtaca gatatcaggt tgaattcgtg tcactcggct    180

tgcaaatcct gcatgtgtac acgatcaatg ccaggcaagt gtcgttgcct tgacattgct    240

gatttctgtt acaaaccttg caagtccagg gatgaagatg atgag                    285

根据本发明的豇豆胰蛋白酶抑制剂，其由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因编码，具体地，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。