[发明专利]用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸标签，尤其是涉及一种用于第二代高通量测序的核酸标签及其设计方法。

背景技术

核酸标签是指已知序列的一小段核酸，通常包含几个到几十个核苷酸(nt)，通过分子生物学方法与待标记的核酸连接来标记该核酸。将核酸标签应用于多样品混合测序，可以区分每条序列来自的样品。

随着第二代DNA测序技术的发展和成熟，测序的通量越来越高，为同时测定多个样本提供了可能。比如Roche/454的GS FLX Titanium测序系统一次可以得到100万条序列，如果同时测定96个样本，每个样本可以得到约1万条序列。目前Roche(罗氏)公司提供了两种同时测定多样本的方法，一是物理分区，把测序反应区平均分隔为2或4或8或16个物理区块，每个物理区块测定1个样本；第二种方法是给每个样本的一端加上一段10个核苷酸的特异标签序列，不同的样本这段标签序列不同，样本混合测序后可以根据这段特异标签序列来追踪样本来源。罗氏公司目前提供成熟的标签有15个。国外的其他研究小组也发表了不同于罗氏公司的标签方法，比如通过PCR方法在序列一端加4nt的特异标签([1]Hoffmann，C.，Minkah，N.，Leipzig，J.，Wang，G.，Arens，M.Q.，Tebas，P.，and Bushman，F.D.(2007).DNA bar coding and pyrosequencing to identify rare HIV drug resistance mutations.Nucleic AcidsRes 35，e91[；2]Kasschau，K.D.，Fahlgren，N.，Chapman，E.J.，Sullivan，C.M.，Cumbie，J.S.，Givan，S.A.，and Carrington，J.C.(2007).Genome-wide profiling and analysis ofArabidopsis siRNAs.PLoS Biol 5，e57)或两端各加上2nt([3]Binladen，J.，Gilbert，M.T.，Bollback，J.P.，Panitz，F.，Bendixen，C.，Nielsen，R.，and Willerslev，E.(2007).The use of codedPCR primers enables high-throughput sequencing of multiple homolog amplification products by454 parallel sequencing.PLoS ONE 2，e197)或10nt的特异标签([4]Parameswaran，P.，Jalili，R.，Tao，L.，Shokralla，S.，Gharizadeh，B.，Ronaghi，M.，and Fire，A.Z.(2007).A pyrosequencing-tailored nucleotide barcode design unveils opportunities for large-scale sample multiplexing.Nucleic Acids Res 35，e130)。在目前的分子生物学实验操作，通常会利用96孔板进行多样本的平行处理，因此在混合测序领域，同时对96个不同DNA样本进行标签也就有了非常实用的价值。而以上公开的方法要么可以区分的样本数太少，无法满足96个样本标签的需要，比如物理分区或2nt的标签；要么标签序列过长，使得引物和接头设计变得复杂和昂贵，比如10nt的标签。针对配合第二代测序系统的96孔板操作的特异标签方法还未见报道。