[发明专利]一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于生化工程技术中植物培养的方法，特别涉及一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法。

背景技术

试管苗玻璃化(hyperhydricity)是指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。玻璃化现象的产生与很多因素有关，如植物组织畸形、木质素含量过低，植物体内会发生乙烯过饱和、细胞通透性降低或气孔关闭等，从而导致细胞内多余水分不能及时排出，发生玻璃化现象。

根据玻璃化程度又分为轻度玻璃化和重度玻璃化。轻度玻璃化苗茎半透明水浸状，叶片狭长，边缘卷曲半透明，茎叶均脆弱易碎。重度玻璃化苗植株矮小，茎透明肿胀，无明显茎节，叶片肥厚、扭曲、透明，茎叶均脆弱易碎。

玻璃化苗绝大多数为来自茎尖或茎段培养物的不定芽。通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是试管苗生产中亟待解决的问题。玻璃化现象的产生与很多因素有关，如植物组织畸形、木质素含量过低，植物体内会发生乙烯过饱和、细胞通透性降低或气孔关闭等，从而导致细胞内多余水分不能及时排出，发生玻璃化现象。

玻璃化苗含水量高于正常苗，因此，玻璃化发生与植物体内含水量过高有关。植物排除体内多余水分方式之一就是靠蒸腾作用。在玻璃化的植物苗中只有一个保卫细胞，而且畸形，形状狭窄，气孔关闭，所以蒸腾作用减少，引进体内水分积累，细胞体积膨胀，液泡程度加剧，细胞质变薄，这一系列变化造成对细胞的挤压，促使气孔进一步关闭。

通常玻璃化苗恢复正常的比例很低，在继代培养中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是试管苗生产中亟待解决的问题。目前，已经有80多种植物有玻璃化现象报道，但试管苗玻璃化后，恢复措施研究相对较少。现有研究认为，培养温度由恒温改为变温、降低培养基中6-BA浓度、增加卡拉胶含量可以使仅部分叶片出现玻璃化的红叶石楠组培苗转为正常苗。蓝莓玻璃化苗恢复研究中也认为，玻璃化试管苗在调整培养温度及玉米素浓度的条件下，可以不同程度的恢复。番木瓜恢复措施研究方面，则认为利用番木瓜营养液培养其玻璃化组培苗能有效地控制玻璃化苗的发生，使其逆向转化。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于：提供一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。

技术方案

一种恢复豆梨玻璃化试管苗的方法，步骤如下：

(1)配制培养基：在MS培养基中添加30g/L的蔗糖，6g/L的琼脂，pH值调至5.6-6.0，并进行高压灭菌处理；

(2)玻璃化试管苗脱水处理：将玻璃化苗放入灭菌的三角瓶空瓶中，加盖无菌封口透气膜，放置72小时，使试管苗组织含水量达50-70％。

(3)玻璃化苗恢复培养：将经脱水处理的试管苗取出，放入上述培养基中培养，在温度为25℃，12h/d光照，光强2000-5000lux的条件下，培养30天。

试管苗脱水处理所用的三角瓶和封口膜均经高温灭菌处理。条件为温度25℃，12h/d光照，光强为2000-5000lux。

有益效果

豆梨生长过程中含水量急剧增加，玻璃化苗超度含水，组织含水量较正常苗高50％以上。本发明在对玻璃化苗适度脱水处理后，转接入无细胞分裂素的培养基上，进行培养，可以有效恢复玻璃化苗，轻度玻璃化苗恢复率在90％以上，重度玻璃化苗恢复率30％以上。是一种简单、易行，又可以高效恢复玻璃化苗为正常苗的技术措施。

附图说明

图1所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗植株形态。

图2所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗叶片扫描电镜观察结果。

a.正常苗叶片气孔分布；b.轻度玻璃化苗叶片气孔分布；c重度玻璃化苗叶片气孔分布；d.正常苗叶片单个气孔；e.轻度玻璃化苗单个畸形气孔；f.重度玻璃化苗单个畸形气孔；g.恢复苗叶片气孔分布；h.恢复苗单个气孔

图3所示为正常苗、轻度玻璃化苗、重度玻璃化苗、恢复苗叶绿体结构透射电镜观察效果。