[发明专利]一种等位基因双敲除打靶载体系统及其构建方法

权利要求书

1.一种等位基因双敲除打靶载体系统，其特征在于：

该系统由pGT-V1和pGT-V2两个互补载体组成，每个载体都包含两个同向的LoxP元件，其间含有两个正筛选标记基因，外侧含有一个负筛选标记基因，即pGT-V1带有正筛选标记新霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因，pGT-V2带有正筛选标记潮霉素基因和红色荧光蛋白基因，二者都含有负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。

2.根据权利要求1所述等位基因双敲除打靶载体系统，其特征在于：所述pGT-V1和pGT-V2两个互补载体还包括两个“8碱基”多克隆位点，其分布在两个LoxP元件与负筛选标记之间以供同源臂的插入。

3.一种等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其特征在于，该方法包括：

1)构建中间载体pIRES-Neo-GFP

1.1)Nhe Ⅰ单酶切pEGFP-C1，Klenow补平后用Bgl Ⅱ单切，同时用EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ双酶切pIRES-neo，凝胶电泳回收EGFP片段及线性化的pIRES-Neo，16℃连接过夜；

1.2)次日挑取单克隆，分别用Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ酶切鉴定；

2)构建中间载体pIRES-Hyg-RED

2.1)BamHI单切pDsRed1-N1，Klenow补平后NotI单切；

2.2)EcoRV/NotI双酶切pIRES-Neo，电泳回收DsRed1片段和pIRES-Neo载体片段，在16℃下连接过夜，得到中间载体pIRES-Neo-RED；

2.3)然后用NotI、EcorI和BamHI双酶切该载体，Klenow补平后加入连接酶，16℃反应过夜，得到灭掉NotI、EcoRI、BamHI，三个位点的pIRES-Neo-RED；

2.4)通过PCR扩增HygromycinB基因，然后将其连接到pMD18-T载体上，得到pMD18T-HYG；

2.5)用XbaI/SmaI双酶切pIRES-Neo-RED，Bgl Ⅱ单酶切pMD18T-HYG后，用Klenow补平后乙醇沉淀，再用Spe1单切后电泳分离，胶回收HYG和pIRES-RED片段，在16℃下连接过夜；

2.6)次日挑取克隆后酶切鉴定，得到pIRES-Hyg-RED，EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定；

3)构建中间载体pBS246/MCS/TK

3.1)将合成的小片段MCS1插入pBS246的EcoRI位点处；MCS2插入SpeI和NdeI位点间构建完成pBS246/MCS；用分别用ScaI和PsyI单酶切检测；

3.2)EcoRl单切pBS246/MCS，Klenow补平后，再用Notl单切，电泳回收；Notl，Swal，Asel三酶切pHSV-TK，电泳回收TK片段；16℃连接过夜；

3.3)次日挑取单克隆酶切鉴定后得到pBS246/MCS/TK；

4)构建打靶载体pGT-V1和pGT-V2

4.1)Xho Ⅰ单酶切pIRES-Neo-GFP和pIRES-Hyg-RED，Klenow补平后用NruⅠ单酶切，电泳回收含Neo-GFP和Hyg-RED片段；

4.2)BamH Ⅰ单切pBS246/tk，Klenow补平后去磷酸化，电泳回收该线性化载体后分别与Neo-GFP和Hyg-RED两片段在16℃连接过夜；

4.3)次日挑取单克隆，酶切鉴定后得到打靶载体pGT-V1和pGT-V2。

4.根据权利要求2所述等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的引物是

以pCEP4为模板，设计引物Hyg-F：5’GAAGATCTTATGAAAAAGCCTGAACTCAC3’；Hyg-R：5’GACTAGTTTTATGAACAAACGACCCAAC3’。

5.根据权利要求2所述等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其特征在于：所述多克隆位点小片段MCS1和MCS2，

其中MCS1：AATTCGCCCGGGCCCTCAGCAGCGCTGGCGCGCCGCTAAGCGGGTCCCGCTAGC；

MCS2：CTAGTTAATTAAGGCCGGCCGACTTAGTCCTGAGGACCGGTGTTTAAACCA。