[发明专利]黄花蒿的遗传转化方法

说明书

技术领域：

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种黄花蒿高效遗传转化方法及应用。

背景技术：

青蒿素是我国学者首次从黄花蒿(Artemisia annuaL.)中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物，是治疗疟疾的特效药，国际市场需求量日益增长。进一步的药理研究证明，青蒿素及其相似物对多种人类和动物肿瘤细胞均具有毒性作用，包括乳腺癌细胞、血癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞等，而对正常细胞损伤很小，并且与传统化疗药不存在交叉耐药。因此，青蒿素及其类似物有望被开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，具有广泛的应用前景，从而导致青蒿素的市场进一步扩大，青蒿素的需求量将进一步上升。

然而，目前药用青蒿素均是从青蒿植株中提取分离而得，由于其含量低，提取环节复杂，安全隐患大，导致青蒿素的生产成本过高。因此，如何有效制备青蒿素是近年来备受关注的难点与热点问题。国内外学者通过栽培、传统遗传育种、组织培养和发根培养等方式试图培育高产植株或生产青蒿素，但迄今为止均未取得令人满意的结果。随着现代分子生物学和基因工程技术的迅速发展，通过基因调控手段大幅度提高植株中青蒿素的含量将成为彻底解决青蒿素生产成本过高问题的必然趋势。Vergauwe和Han等分别报道了根癌农杆菌介导的黄花蒿转化方法，虽然Vergauwe等利用万古霉素(vancomycin)作为农杆菌抑制剂，成功地得到转基因植物，但vancomycin十分昂贵，且严重推延了再生苗的产生。Han等虽然以头孢霉素为农杆菌抑制剂也得到了转基因植株，且仅局限于特定的基因型植株和特定的表达载体。此外，这两种转化体系均存在转化率低和转化时间长的缺点，未得到推广应用。因此，构建成本低、转化率高、重复性好的黄花蒿遗传转化再生体系仍然是黄花蒿资源改良急需解决的主要问题。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种黄花蒿的遗传转化方法，以黄花蒿的节间茎为转基因的受体材料，采用农杆菌介导法将外源基因导入黄花蒿受体细胞中，经过选择再生获得转化植株，以缩短现有技术获得转基因植株的时间，提高现有黄花蒿遗传转化的效率。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种黄花蒿的遗传转化方法，该方法包括如下步骤：

1)、黄花蒿无菌苗的准备：将黄花蒿种子灭菌后接种于1/2MS培养基上，在每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％的条件下培养，7天后转至MS培养基，每40天继代繁殖一次；

2)、菌株的活化及浸染菌液的制备：将携带目的基因的农杆菌划线培养在含有100mg/L卡那霉素的L B固体培养基上，28℃黑暗培养2天，使其活化，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃振荡培养，取达到对数生长期的菌液即OD₆₀₀为0.6-0.7，离心，弃上清液，收集菌体悬浮于MS液体培养基稀释至OD₆₀₀＝0.3，加入80-120μM乙酰丁香酮，得到用于转化的浸染液；

3)、侵染和共培养：取继代苗龄为30-40天的黄花蒿无菌苗枝梢，去叶芽，切成1-3厘米长的茎，置于步骤2中的侵染液，间歇摇动使外植体与菌液充分接触，浸染时间为15-30min；取出侵染过的外植体，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入共培养培养基：MS培养基+100μM乙酰丁香酮，于25℃、黑暗条件下共培养48-60h；

4)、不定芽的诱导I期：将共培养后的外植体转移至诱导培养基：MS+0.1mg/L噻二唑苯基脲(TDZ)，并添加400mg/L羧苄西林(Carb)和25mg/L卡那霉素(Kan)，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；

5)、不定芽的诱导II期：2周后，将步骤4中的外植体转入含300mg/L羧苄西林(Carb)和25mg/L卡那霉素(Kan)的MS+0.05mg/L1-萘乙酸(NAA)+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)培养基，每周更换新鲜培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；

6)、选择性生长培养：3周后，将步骤5中的培养材料转入含300mg/L羧苄西林(Carb)和25mg/L卡那霉素(Kan)的MS+0.2mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)伸长培养基，培养条件为每天16小时、3000lux光照，8小时黑暗，温度25℃，相对湿度40％；