[发明专利]猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液

说明书

技术领域

本发明涉及发育生物学，具体涉及一种猪早期胚胎发育前期培养液及猪胚胎后期培养液。

背景技术

早期胚胎培养是胚胎生物技术的基础和关键环节，对于体外受精、胚胎分割、胚胎嵌合、核移植和转基因动物的构建都具有重要的意义。现有的早期胚胎培养系统能够成功地支持重构胚发育到囊胚阶段，但是发育至囊胚比率没有体内高，而且体外培养系统培养的胚胎质量也差于体内胚胎。人们对早期胚胎发育的机制仍知之甚少，同时体外培养也不能完全模拟体内环境：一方面，体内胚胎处于微量的液体环境中，而在体外培养的胚胎多置于较多的培养液中，使得胚胎自分泌产生的因子均被稀释而无效果。另一方面体内胚胎始终处于一种动态的环境中，胚胎通过输卵管到达子宫的过程中周围的营养环境持续变化，以满足胚胎不同发育阶段的营养需求；而在体外培养时，许多传统胚胎培养系统是一个静止的环境，在整个植入前时期只有一种培养基。此外，体外培养系统中也缺乏任何雌性生殖道旁分泌因子。总的来说，现阶段体外培养的胚胎在数量上和质量上都不如体内胚胎，这告诉我们胚胎的体外培养体系还不十分完美，还需要继续深入研究并建立更好更接近生理环境的培养系统。

目前猪的胚胎从合子到囊胚在体外有以下几种体外培养液：如改良的Whitten培养液、北卡罗来纳州立大学研制的培养液(North Carolina State University (NCSU23/NCSU37)、改良的Chatot, Ziomek, Bavister 培养液、Beltsville embryo culture medium (BECM)培养液和PZM系列(PZM-3/PZM- 4/PZM-5)培养液。其中NCSU23是公认的这其中最成功的培养液，它基本能满足其发育至囊胚的代谢和营养需要。然而这些经体外培养后的胚胎经胚胎移植后，其妊娠率和窝均产仔数均很低，发育至囊胚的细胞数也显著低于体内胚胎，我们还需要对体外培养液进行改进，以提高猪早期胚胎体外生产效率。

发明内容

发明人经大量深入研究，在NCSU23猪胚胎培养液的基础上，通过在猪早期胚胎（即猪孵化囊胚前的胚胎）发育前期阶段和后期阶段添加及删减某些营养物质或抗氧化剂，大大提高了猪克隆胚胎和孤雌激活胚胎的体外发育效果。两种胚胎利用本发明的猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液培养后，囊胚率和内细胞团数均要显著高于NCSU23和NCSU37。

本发明的目的之一在于提供一种pH值为7.3±0.02的猪早期胚胎发育前期培养液，用于猪早期胚胎发育的前期培养，即前60h的培养，具体成份包括：NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、NaHCO₃、BSA（牛血清白蛋白），其特征在于还包括：乳酸钙和丙酮酸钠。研究表明，高浓度的葡萄糖对猪4细胞前的胚胎有抑制其体外发育作用，而在4细胞以后，一定浓度的葡萄糖则可以促进囊胚的形成。本发明中，NaCl的主要作用是维持整个培养液的渗透压（当然其他物质也提供渗透压）；KCL为K离子主要来源（KH₂PO₄也部分提供K离子），且生理状态下Na离子和K离子通常维持在一定比例，通常为20:1。KH₂PO₄和NaHCO₃为一对缓冲体系，主要起维持培养液pH值的作用。BSA起到营养细胞的作用。在猪早期胚胎发育的前期用低浓度的Na-pyruvate（丙酮酸钠）和Ca-(lactate)₂·5H₂O（乳酸钙）代替葡萄糖作为能量物质，60h后恢复葡萄糖，部分提高了胚胎的发育效果。同时乳酸钙中的钙代替氯化钙作为钙源。