[发明专利]一种可代谢木糖的酿酒酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种可代谢木糖的酿酒酵母工程菌。

背景技术

石油资源的日渐枯竭，使燃料乙醇的生产和应用在经济发展和战略安全上显示出重大意义。同时，国际粮食价格的不断飙升成为燃料乙醇大规模生产和推广的瓶颈。自然界丰富的植物纤维资源中，目前只有3-4％被有效利用。木糖在木质纤维素水解物中含量高达30％，是仅次于葡萄糖的一种单糖，充分利用木糖发酵生产乙醇，可以大大降低生产成本(J.N.Nigam，2001)。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为单细胞真核生物，易培养、生长周期短，已广泛应用于异源基因的表达。虽然酿酒酵母能够高产乙醇并对木质纤维素水解液中的抑制物有较强抗性(Tang YQ et al.，2006)，但不能利用木糖，而只能利用其异构体木酮糖，使酿酒酵母无法成为木质纤维素乙醇生产的优势菌株。所以构建能利用木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌株的重要途径之一是克隆天然利用木糖的酵母菌的两个关键酶基因，即木糖还原酶基因XYL1(xylose reductase)和木糖醇脱氢酶基因XYL2(xylitoldehydrogenase)，并使其在酿酒酵母细胞中表达。

酿酒酵母以其高效的产乙醇能力和较强的乙醇耐受性成为乙醇和食品行业的重要生产菌株。但其最适发酵温度是25℃至30℃，在生产过程中往往需要向发酵罐喷洒大量的冷凝水(Kiran Sree.et al.，2000a；Sridhar etal.，2002)或使用其它手段加以降温，这无疑增加了生产成本和污染风险。乙醇发酵工业中，酵母发酵前将原料液降温至30℃的成本占总生产成本的30％左右，而若只降至37℃左右，则可降低10％的生产成本。

发明内容

本发明提供了一种可代谢木糖的酿酒酵母工程菌，该酿酒酵母工程菌可以木糖为唯一碳源，发酵产生乙醇。

一种酿酒酵母工程菌，包括宿主细胞和重组载体，其特征在于：所述重组载体中包含由第一启动子、木糖还原酶基因、第二启动子、木糖醇脱氢酶基因以及抗性标记基因依次连接组成的基因表达盒。

所述的第一启动子为酿酒酵母磷酸丙糖异构酶启动子(pTPI)，所述的第二启动子为酿酒酵母磷酸甘油激酶启动子(pPGK)。该两种启动子均为组成型启动子，不受葡萄糖抑制，无需木糖诱导。

所述的木糖还原酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，所述的木糖醇脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.9所示。之所以采用P.stipitis作为基因来源，主要在于其使用不同辅因子时的酶活比为0.65(NADH/NADPH)，较其它酵母的这一比值更高，因此将其木糖还原酶基因和木糖脱氢酶共表达于受体细胞中时，有助于减轻胞内氧化还原不平衡情况，从而减少副产物积累。

所述的抗性标记基因为G418抗性基因，便于酿酒酵母阳性转化子的筛选。

所述的宿主细胞为酿酒酵母CBS 1200，该细胞可耐高温。

所述的重组载体包含酿酒酵母的同源序列，重组载体能够整合到宿主的染色体中，提高遗传稳定性。所述的同源序列如SEQ ID NO.13所示。能将基因以高拷贝数整合于酿酒酵母rDNA重复序列上。

本发明酿酒酵母工程菌可以同时表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，能够以木糖为唯一碳源生长，为后续构建木糖和葡萄糖共发酵产乙醇的工程菌株奠定了基础，并可以该工程菌株为基础进一步筛选和改造，使其以木质纤维素为原料生产乙醇，从而大大降低乙醇的生产成本。

附图说明

图1为表达载体的P-R-K的物理图谱；

图2为表达载体的pB-D的物理图谱；

图3为表达载体P-RD-K的物理图谱；

图4为表达载体PK-rDNA的物理图谱；

图5为检验重组菌株为阳性菌株的电泳图谱。

具体实施方式

实施例1启动子、木糖还原酶基因和G418抗性基因表达盒的构建

1、树干毕赤酵母基因组DNA的提取

将树干毕赤酵母(Pichia stipitis CBS 5774)接种于YPD液体培养基中，30℃、180r/min培养16h，富集细胞。

收集过夜培养的酵母细胞，STES缓冲液悬浮、洗涤后，重悬细胞；向酵母悬浊液中加入一定比例酸洗玻璃珠及苯酚/氯仿，充分混合震荡、离心后上层水相用乙醇沉淀；离心后收集核酸沉淀，即为基因组DNA。

2、PCR扩增木糖还原酶基因(XYL1)