[发明专利]一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13，其特征在于，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO： C2010127。

2.一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的制备方法，其特征在于

具体制备步骤如下：

A. pLJM1-GFP-CYP2A13质粒构建及验证

通过内切酶双酶切以及酶连的方法构建含有目的CYP基因的慢病毒质粒pLJM1-GFP-CYPs，即对本实验室现有的pFastBac^TM 1-CYP2A13质粒与慢病毒专用空载质粒pLJM1-GFP同时进行酶切，回收酶切产物后分别进行酶连，然后转化DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆提取重组质粒，对重组质粒使用各基因特异引物进行PCR验证；

B. 慢病毒载体包装以及感染BEAS-2B细胞

传293T细胞至60mm培养皿中，细胞密度达到80-90％融合度时进行转染；制备脂质体转染复合物：DMEM 无血清，无双抗，转染每皿的复合物含6ug pLJM1-GFP-CYPs质粒、3ug pVSVG、4.5ug delta 8.91以及15ul Sofast转染试剂，将复合物加至培养皿中的DMEM液面下，吹打3-4次混匀， 将此细胞放至37℃ CO₂培养箱培养，6-8h后更换新鲜完全培养基； 转染24h后，通过观察293T细胞绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率；收集病毒上清，此即为含有CYP2A13基因的完整慢病毒上清；使用该完整慢病毒上清过滤后感染BEAS-2B细胞，同时加入10ug/mL的polybrene和HEPES；感染24h后重复感染一次；构建稳定表达CYP2A13的BEAS-2B细胞BEAS-2B/CYP2A13；

C. BEAS-2B/CYP2A13细胞的验证

分别收取慢病毒感染成功后一周和两周的各BEAS-2B/CYP2A13细胞总蛋白，使用CYP2A13的特异性抗体，采用免疫印迹方法验证BEAS-2B/CYP2A13细胞中的蛋白表达；

D. 流式细胞仪分选BEAS-2B/CYP2A13细胞株

为保证转染细胞的纯度，使用流式细胞仪对BEAS-2B/CYP2A13细胞株进行了GFP阳性细胞分选；未转染的正常细胞无荧光，转染细胞的荧光强度明显增强，通过分选，将荧光强度较强的细胞分选出来，以保证细胞为100%转染细胞；

E. BEAS-2B/CYP2A13单克隆细胞的挑选及验证

将GFP阳性的BEAS-2B/CYP2A13细胞，以每孔1个细胞的浓度接种到96孔细胞培养板，结果7-10天后，对形成单克隆的细胞进行放大培养，直到细胞满足实验和保存要求为止；对筛选出的单克隆细胞进行验证，选取CYP2A13蛋白表达高且稳定的细胞作为后续实验和保存之用。

3.一种人肺细胞BEAS-2B/CYP2A13的应用，其特征在于利用CYP2A13的特征性底物黄曲霉毒素B1对细胞进行测试；使用0-10,000 nM的AFB1，处理细胞24 h，采用MTT法评价剂量-效应关系；使用100 nM 处理细胞24-72小时，采用MTT法评价时间-效应关系；通过与空载细胞BEAS-2B/Vector进行比较，评价BEAS-2B/CYP2A13细胞对AFB1的敏感性。