[发明专利]一种从霞水母刺丝囊毒素内分离热激蛋白60的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体的说是一种从霞水母(Cyanea nozakii)刺丝囊细胞毒素中分离纯化热激蛋白60(Heat Shock Protein60，Hsp60)的方法。

背景技术

热激蛋白(Hsp)又称热休克蛋白或应激蛋白，是细胞在应激原刺激下所生成的一组蛋白质。根据其分子量的大小可将Hs p分为高分子量热激蛋白(HMW-Hsp)和低分子量热激蛋白(LMW-Hsp)。HMW-Hsp主要合成于哺乳动物、昆虫和酵母等细胞中，可以和激素结合，维持其特殊构象，LMW-Hsp主要合成于植物中。按照SDS电泳的表观分子量大小可以把Hsp分为五大类：Hsp100、Hs p90、Hsp70、Hsp60及小分子量热激蛋白sHsp。Hsp的生理功能一致认为其具有分子伴侣作用，即协助蛋白质跨膜运输，防止蛋白质前体积累并协助蛋白质跨膜转移，与未折叠蛋白质形成络合物以维持其转移能力，维持蛋白质的正常折叠状态，促进错误折叠的蛋白质降解；在蛋白质从头折叠及应激条件下能起到稳定多肽链、防止蛋白质失活的作用。它参与靶蛋白活性和功能调节，却不是靶蛋白的组成部分。

热激蛋白的提取纯化方法根据不同的材料其具体方法也不尽相同，例如从鲤鱼的肝脏中提取热激蛋白的方法是，先将鲤鱼肝脏组织破碎后超声波破碎提取，然后在将其盐析后上DEAE纤维素离子交换层析和凝胶过滤G75后获得Hsp70。此外有人采用低渗匀浆、超速离心、ConA-Sepharose亲和层析、ADP-Agarose亲和层析和DEAE离子交换的亲和层析，从热处理的小鼠肝癌细胞中分离纯化到Hsp70。还有研究者用腺苷二磷酸琼脂糖柱免疫亲和层析法从水牛淋巴细胞中纯化到Hsp70。但是到目前为止还很少有关Hs p60的提取研究报道。

Hsp60是热激蛋白重要的成员之一，它的结构高度保守，在电子显微镜照片上，Hsp60分子均由14个亚基组成，每七个亚基构成一个环状，整体结构象两个面包圈垒成的桶，这个桶的内腔为折叠蛋白提供了一个保护性环境。Hsp60s最重要的功能之一就是作为分子伴侣参与新生肽链的折叠、寡聚蛋白质组装和蛋白质的跨膜运输线粒体。Hsp60主要参与核编码的运输入线粒体的蛋白质的加工、定位和装配。它还能够影响线粒体膜上F₁-ATP酶复合体的装配和线粒体蛋白FieskeFe/s和eytobz正确加工和定位。叶绿体内Hsp60是由核基因编码，在非热激条件下含量很高。Hsp60另一重要功能是在胁迫下的起到保护作用。当在热激或是外界刺激下，体内变性蛋白急剧增加，此时Hsp60可与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态，在有Mg²⁺和ATP存在下能够使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象，或者降解。

霞水母属刺胞动物门，钵水母纲，旗口水母目，霞水母科，触须4m-6m.广泛分布于我国沿海，尤其夏季会在近海区域集中出现，给渔业生产、生态环境以及游泳者都造成了严重的影响，尤其是毒素能使被蜇伤者出现皮疹、瘙痒、水肿、肌肉疼痛、血压降低、呼吸困难甚至死亡等现象。水母毒素中含有重要的功能蛋白和生物活性蛋白，其中科学家已经从其中分离出具有溶血活性、神经毒性以及致死活性的蛋白质(文献1：Chung，J.J.，et al，2001.Partial purificationand characterization of a hemolysin(CAH1)from Hawaiian box jellyfish(Carybdea alata)venom.Toxicon 39，981-990.文献2：Sanchez-Rodriguez，J et al.Partial purification and characterization of a novel neurotoxin and three cytolysins from box jellyfish(Carybdea marsupialis)nematocyst venom.Archives of Toxicology，2006，80：163-168.文献3：Nagai，Hiroshiet al，Isolation and Characterization of a Novel Protein Toxin from the Hawaiian Box Jellyfish(Sea Wa sp)Carybdea alata，Biochemical and Biophysical Research Communications.2000，275：589-594)，但是到目前为止还没有从霞水母毒素中分离到热激蛋白60的报道。

发明内容