[发明专利]一种基于银增强的甲羟孕酮的检测方法

权利要求书

1.一种基于银增强的甲羟孕酮的检测方法，其特征在于基于胶体金标记及银沉积增强检测信号的超灵敏检测方法，共分5个步骤：（1）胶体金的制备，（2）抗体的胶体金标记，（3）胶体金表面银原位沉积、溶解及测定，（4）建立标准曲线，（5）实现实际样品中甲羟孕酮MPA的检测；

（1）胶体金的制备：

向处理过的干净的三角烧瓶中加入50 mL质量浓度为0.01%的氯金酸溶液，搅拌，加热至沸腾，保持5min；一次性加入质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液2mL，边加热保持沸腾边搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深蓝黑色最后变成酒红色，当颜色不再变化后，继续加热沸腾15 min使反应充分完全；最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，加蒸馏水定容到50mL，得胶体金溶液，4℃保藏备用；

（2）抗体的胶体金标记：

用0.1M的K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值为9.0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗体，使羊抗兔二抗抗体的浓度为100μg/mL，并在室温下反应4h后，离心并重新分散于0.01M pH7.4的PBS缓冲溶液中，得50μg/mL的金标羊抗兔二抗，4℃保存备用；

（3）胶体金表面银原位沉积、溶解及测定：

用100 mL MPA-OVA的包被原包被96孔板，4℃过夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包被原；用含1% BSA的0.01 M PBS封闭96孔板，在37℃孵育1h，用PBST溶液洗板3次；向96孔中加入不同浓度MPA的标准溶液或实际样品溶液，加MPA的兔一抗，并在37℃孵育2h；用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100μL 的50μg/mL金标羊抗兔二抗，在37℃条件下孵育2h；用PBST溶液3次洗板之后，每孔加入100μL的银还原体系反应30min，用PBST溶液洗板5次后，向每孔加入200μL的浓硝酸，然后震荡反应2h，提取每孔的银溶液后，用原子吸收光谱进行定量分析；

所述银还原体系由 (a) 质量浓度2%的明胶溶液6mL，(b) 质量浓度5.7% 对苯二酚3mL，(c) pH 3.5 柠檬酸缓冲液1mL，和(d) 质量浓度2% AgNO₃溶液200μL四种溶液组成的银还原体系；

（4）建立标准曲线：根据步骤（3）所述由原子吸收光谱测定的银的浓度值，建立MPA的浓度与银的浓度值之间的关系，建立标准曲线；

（5）实现实际样品中MPA的检测：步骤（3）中的由实际样品溶液所测得的银的浓度值与标准曲线对照，确定实际样品中MPA的浓度。