[发明专利]一种从水稻种子中提取重组人血清白蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从水稻种子中高效提取重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。

背景技术

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。每升人血含有HSA约40g。HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多疏水性生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。

目前，临床上使用的HSA主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，这种制备途径存在以下缺点：一方面血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求；另一方面血液自身也可能存在风险，例如可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的HSA存在巨大的担忧。因此，寻找其他途径生产人血清白蛋白成为当务之急。

随着现代DNA重组和合成技术的发展，研究人员对重组人血清白蛋白(rHSA)的生产和应用产生了极大的兴趣。迄今为止，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产rHSA，例如利用原核生物如大肠杆菌(Latta，M.et al.，Bio/Technology，5：1309-1314，(1987))、枯草芽孢杆菌(Saunders，C.W.et al，J.Bacteriol.169：2917-2925，(1987))，真核生物如酵母(WO 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、动物细胞培养等生产rHSA。但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。

本发明人的中国专利申请No.200510019084公开了一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产rHSA的方法，包括利用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导rHSA进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使rHSA能在水稻种子内大量积累，最终达到较高的表达水平。所得的rHSA的表达水平至少达到水稻种子重量的0.3％以上。该方法具有表达量高、成本低的优势，为蛋白药物的生产开辟了一条新途径。

目前，还没有从转基因水稻中提取rHSA的成熟生产工艺，建立从转基因水稻种子的提取蛋白质的方法和工艺，最大限度地增加目标蛋白的提取效率、降低非目标蛋白的提取率是研究和开发工艺的关键要素。提高rHSA的提取得率是提高生产效率并降低生产成本的最有效途径。本发明建立了从水稻种子中规模化高效提取重组人血清白蛋白的工艺和流程。

发明内容

本发明的目的是提供一种从转基因水稻中高效提取重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种从转基因水稻中提取重组人血清白蛋白的方法，包括步骤：

1)将含有重组人血清白蛋白的转基因稻谷去壳、稻米粉碎后获得的转基因米粉与提取缓冲液混合，搅拌提取，得混合物I；

2)调节步骤1)的混合物I的pH至4.0～4.5，室温沉淀3～12小时，得混合物II；

3)过滤步骤2)的混合物II，收集滤液，获得含有高浓度重组人血清白蛋白的溶液。

具体地，步骤1)中，根据重组人血清白蛋白在存在于水稻胚乳细胞的淀粉粒之间，为了去除杂蛋白的提取率，将含有重组人血清白蛋白的转基因稻谷去壳后，糙米粉碎为80～120目的米粉，以提高重组人血清白蛋白的提取效率。

所述提取缓冲液包含20～30mM磷酸盐缓冲液、10～20mM醋酸钠、10～20mM硫酸铵与5～20mM辛酸钠，提取缓冲液的pH为6.5～8。

为了获得最高重组人血清白蛋白的提取率和平衡提取体积与提取效率的关系，米粉与提取缓冲液可以以重量/体积比(kg/l)，米粉重量/提取缓冲液体积)1∶5～1∶10的比率混合，以每分钟60转的速率进行搅拌提取1～3小时。经过实验发现，1∶5～1∶10之间的对总蛋白和重组人血清白蛋白的提取量没有明显影响，从降低成本和减少体积考虑，所述转基因米粉与提取缓冲液优选地以重量/体积比(Kg/L)1∶5混合，提取时间优选为1～1.5小时。