[发明专利]一种肽核酸探针、含有该肽核酸探针的组合物及其用途

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种肽核酸探针，具体地，涉及一种用于检测分枝杆菌特别是结核分枝杆菌复合菌群的肽核酸探针。本发明还涉及含有该肽核酸探针的组合物、用于检测分枝杆菌的检测剂、用于检测分枝杆菌的试剂盒、一种原位杂交方法、一种检测分枝杆菌的方法、所述肽核酸探针在制备检测分枝杆菌的试剂中的用途、以及所述肽核酸探针在制备检测结核病的试剂中的用途。

背景技术

结核病是一种经呼吸道传播的慢性传染病，主要由结核分枝杆菌复合菌群(Mycobacterium tuberculosis Complex，MTC)引起，其中最主要的是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

目前临床上检测结核分枝杆菌最常用的方法是涂片染色镜检法，包括抗酸(Ziehl-Neelsen)染色法和荧光染色法。涂片染色镜检法优点是简单、快速、成本低，缺点是灵敏度低，例如当样本内含菌量少时，往往容易得出假阴性结果。

由于涂片染色镜检法灵敏度低，所以涂片阴性的样本还要继续使用分离培养法(罗氏培养法)进行进一步确定。分离培养法的结果相对可靠，特异性高，是目前结核病诊断的金标准。但是由于结核分枝杆菌的生长速度缓慢，大约需要4到8周才能得出结果，不利于对患者作出快速诊断和及时治疗。而如果使用结核菌快速培养仪，可以缩短一些培养时间，不过仪器价格昂贵，还需要专门进口专利的培养基，费用较高。

此外，PCR方法也被引入结核分枝杆菌的检测领域。这种方法可以在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增加，在此基础上进行探针杂交，提高了检出的灵敏度和特异性。但是缺点是非常容易出现假阳性。并且由于样本中有可能有如血色素等抑制剂的存在导致出现假阴性的情况，所以限制了PCR方法的临床应用。

肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)是一类具有类多肽骨架的DNA类似物，由聚N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代DNA分子中的磷酸戊糖骨架，四种碱基通过亚甲基羰基与骨架相连。由于肽核酸是一种不带电荷的中性分子，它可以高度亲和并序列特异地与DNA或RNA结合形成稳定的复合体，形成的杂交复合物具有相当高的热稳定性以及独特的耐离子强度变化的性质，并且不易被核酸酶和蛋白酶所降解。

已经有文献报导了两种检测结核分枝杆菌的肽核酸探针(Stenderet al.，Fluorescence In situ hybridization assay using peptidenucleic acid probes for differentiation between tuberculous andnontuberculous mycobacterium species in smears ofmycobacterium cultures.J Clin Microbiol.，1999，37(9)：2760-2765；Lefmann et al.，Evaluation of peptide nucleicacid-fluorescence in situ hybridization for identification ofclinically relevant mycobacteria in clinical specimens andtissue sections.J Clin Microbiol.2006；44(10)：3760-3767.)，但是这两种探针杂交后的信号偏弱。部分可能的原因是探针序列的特异性不是很好，以及未使用连接器(linker)将荧光素基团与PNA链间隔开，造成PNA链与靶序列结合时存在空间位阻效应，影响杂交效率。

发明内容

本发明人经过大量的实验和创造性的劳动，出乎意料地发现了一种信号强度高并且特异性好的肽核酸探针，其可以有效、快速地检测分枝杆菌特别是结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌复合菌群。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种肽核酸探针，其碱基序列为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2中连续的10-20个碱基；具体地，为连续的13-18个碱基，更具体地，为连续的14-17个碱基，进一步具体地，所述肽核酸探针的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：1-3的碱基序列如下所示：

5’-TGGCCTATCCTGGTGCCCTACGTACAGAACACCACCTTTCGCG-3’(SEQ IDNO：1)；