[发明专利]狗B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及狗B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆、表达技术。

背景技术

人B淋巴细胞刺激因子（hBAFF）是1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相关的肿瘤坏死因子家族成员，主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓中表达。hBAFF具有很强的B细胞趋化性，体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等，对于休眠B细胞，hBAFF虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但它通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L的表达，可延长休眠B细胞的寿命。体内它可以促进脾脏内T1-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。hBAFF的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件。BAFF-/-小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失。hBAFF刺激B细胞增殖、分化并分泌抗体，成熟的B细胞及其产生的抗体构成了机体抵御感染和抑制肿瘤滋生的关键组分。由于hBAFF的免疫增强特异活性，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前景。2000年11月，美国FDA已正式批准重组人hBAFF进入人体临床试验，用于治疗普通变异免疫缺乏症（CVID）患者。

根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前人、鼠、猪、牛、羊、兔、鸡、鸭、鹅的BAFF cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别是AF116456、AF119383、EF041845、EU213012、FJ793192、EF202603、 AF506010、DQ445092及DQ874394。狗B淋巴细胞刺激因子（dBAFF）cDNA还未被克隆出来，关于狗BAFF基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。

狗不仅给我们提供鲜美的肉类、还能看家、放牧、并作为公安、军队的得力战将，保护国家、人民的财产安全，被誉为“人类最忠实的朋友”。随着人们生活水平的提高，宠物狗也逐渐与人们的生活息息相关，是饲养率最高的宠物。因此，狗的疾病的预防及控制已成为大家关心的问题。由于B淋巴细胞刺激因子（BAFF）具有较强的免疫增强能力，基因工程狗BAFF蛋白有可能开发成一种能增强狗类免疫能力的生物制剂，以增强犬类的免疫能力。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的细胞因子得以克隆及重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市，给治疗疾病提供了新的手段，同时创造了巨大的经济和社会效益，因此，重组dBAFF蛋白具有潜在的巨大市场应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从狗提取的B淋巴细胞刺激因子cDNA，并提供狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法及重组技术。

本发明从狗中克隆到B淋巴细胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明的狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法如下：

（1）从狗脾脏组织提取总RNA

（2）利用RT-PCR方法通过同源克隆（homology cloning）策略并结合cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆狗全长BAFF cDNA序列 SEQ ID NO.1。

上述狗B淋巴细胞刺激因子cDNA的克隆方法具体操作如下：

（1）利用Trizol试剂一步法提取狗脾脏组织总RNA

（2）通过Clustal w软件分析人、鼠、鸡、鸭、鹅、猪 BAFF cDNA保守区，设计兼并引物dBAFF1：5'-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3'（SEQ ID NO.4）；dBAFF2：5'-GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3'（SEQ ID NO.5）进行PCR扩增，得到340bp的片段P1。

（3）用已得到的上述同源克隆片段P1设计特异性引物（GST2：5'-CGCAAAGCTGGAAGAAGGAGATGAG-3'，SEQ ID NO.6；GST3：5'-GTCCCATGGCAAAG GTGTTATCGGTG-3'，SEQ ID NO.7）。3' RACE扩增得到BAFF全长cDNA 3' 末端片段P2（包括3' UTR），5' RACE扩增得到BAFF全长cDNA 5' 末端片段P3（包括5' UTR）。将获得的P1、P2、P3三条序列以BLAST2软件拼接，获得BAFF全长cDNA (SEQ ID NO.1)。