[发明专利]斑马鱼B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重组应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及B淋巴细胞刺激因子cDNA及其克隆和重组应用。

背景技术

BAFF具有很强的B细胞趋化性，在体外作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等。对于休眠B细胞，BAFF虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L的表达，可延长休眠B细胞的寿命。在体内，它可以促进脾脏内T1-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。BAFF的正常表达是GC形成、抗体亲和力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件BAFF^-/-小鼠的次级淋巴器官囊外及过渡区B细胞完全缺失，而BAFF转基因小鼠则由于B220⁺细胞数目剧增而引起脾脏、淋巴结、派尔斑(Peyer’s patch)肿大，血清中IgM、IgG、IgA、IgE滴度上升，8周后出现与典型SLE(系统性红斑狼疮)相似的症状。最近的研究显示BAFF还具有调节B细胞分化的作用。BAFF在体外能促进B系淋巴瘤的增殖，并抑制FasL-Fc和TACI-Fc的促凋亡作用，提示其还可能具有抑制细胞凋亡的作用。

由于T细胞表面表达BAFF特异性受体BAFF-R，且用抗BAFF-R的单克隆抗体能阻断BAFF对T细胞的增殖效应，因此推测BAFF通过BAFF-R对T细胞的激活和分化起共调节作用。

有专家认为,BAFF是B细胞存活的关键因子，犹如针对B细胞的一个精妙的安检站。过度表达BAFF可以减少B细胞的耐受性，产生免疫反应。目前临床实验得到的结果证明了BAFF在类风湿性关节炎(RA)发病中的病理学角色。研究发现，存在于骨髓中的B细胞的发育和选择不依赖于BAFF，但当B细胞离开骨髓，便成为外周B细胞存活和成熟以及T、B细胞激活的主要细胞因子。

BAFF不仅是B细胞的存活因子，还对T细胞激活有共刺激作用。最新研究表明，BAFF的表达水平与感染和炎症反应密切相关。

T、B细胞在自身免疫疾病中起到了重要作用，而BAFF主要表达在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和活化的T细胞表面，分泌细胞因子、生长因子和各种介质，使B细胞活化为浆细胞，分泌大量免疫球蛋白，包括自身抗体，使机体出现炎性反应和破坏。

BAFF是B细胞活化的正调节蛋白。通过实验研究发现，与正常对照组比较，RA患者的BAFF血清水平明显增高，B细胞活化的标记物可溶性CD23(sCD23)同样有明显升高，但二者相比无相关性。进一步研究发现，BAFF与RF具有相关性，表明BAFF在RA中作用是诱导自身抗体的产生，而不是B细胞的活化。

干燥综合征中BAFF及其受体在唾液腺局部表达的作用，进一步研究表明这些细胞因子具有活性，可以延长正常B细胞的存活。在SS中，BAFF的表达不仅来源于上皮细胞和T细胞，还来自于B细胞，通过自分泌发挥免疫作用

各种研究表明，许多恶性B系肿瘤异常表达BAFF和APRIL，并且这些肿瘤细胞表面表达一种或多种BAFF与APRIL受体。人们也研究了“诱饵受体”BCMA-Fc、TACI-Fc及BAFF的单克隆抗体对这些B系肿瘤抑制的影响，发现这些抗体及抗体类似物均能恢复这些肿瘤细胞的凋亡作用。

BAFF/APRIL配体-受体系统极有可能成为对抗多种恶性肿瘤的分子靶点库。

根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前已知BAFF基因序列的鱼类包括虹鳟鱼, 大西洋鲑鱼, 斑点绿河豚；APRIL基因序列包括虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰,并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别是ABC84582、NP_001135232、SINFRUP00000153079、EF451543、DY736744、CB940845。斑马鱼B淋巴细胞刺激因子(zBAFF) cDNA还未被克隆出来，关于斑马鱼BAFF基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。

斑马鱼(Danio rerio)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼。原产自印度东部、巴基斯坦、缅甸、孟加拉国等南亚地区，是一种常见的热带鱼。斑马鱼是国际标准化组织认可的5种鱼类实验动物之一，已经成为发育生物学、遗传学、毒理学等研究常用的模式生物。