[发明专利]水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位点突变体

说明书

技术领域

本发明属微生物领域，涉及一种水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位点突变体，具体涉及一种利用DNA分子重排方法和功能互补法对从来自水生拉恩氏菌中编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)基因进行改造的多位点突变体，该改造后的多位点突变体对草甘膦的抗性能力大幅度提高。

背景技术

草甘膦(glyphosate)的广泛使用及其非选择性的特点，促使克隆草甘膦抗性基因、培育抗草甘膦转基因作物成为研究热点。我国作为草甘膦生产和出口的大国，目前尚没有具有自主知识产权的、适用于转基因抗草甘膦作物的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase](EPSP合酶)(EC2.5.1.19)基因，因而在国际竞争中处于不利地位。因此，寻找具自主知识产权的高抗草甘膦EPSP新基因，开展对EPSP活性位点的研究，对寻找抗草甘膦新基因中的专利保护位点以及改造、利用新基因培育新型抗草甘膦转基因作物均具有积极意义。

莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径，EPSP合酶是莽草酸途径的关键酶，即催化3-磷酸莽草酸(S3P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成5-烯醇式丙酮酸-3磷酸莽草酸(EPSP)。除草剂草甘膦是PEP的结构类似物，能与PEP竞争性抑制EPSP的活性，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。但迄今为止，成功用于商业化的抗草甘膦转基因作物的基因只有CP4-EPSP基因，CP4-EPSP属于II型EPSP，有不同于植物EPSP基因的核苷酸顺序，转录翻译后的EPSP合成酶对草甘膦不再敏感，因而具有对草甘膦的耐药性，其催化活性介于植物和大肠杆菌之间。

许多本身无抗性或抗性不高的EPSP合酶，通过突变其氨基酸而降低与草甘膦之间亲和性来产生草甘膦抗性的同时，也降低了与PEP之间的亲和性，使酶活性不足，难以应付反应所需。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位点突变体，具体是采用分子体外重组方法寻找一种EPSP合酶突变体，该突变体保持了对PEP之间的高亲和性，同时降低了与草甘膦除草剂之间亲和性，从而大幅度提高了对草甘膦的抗性能力。

本发明所述的水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra多位点突变体，采用分子体外重组筛选高活性EPSP合酶基因AroA-Ra，通过载体构建、功能互补菌株筛选、多位点突变技术验证以及植物表达等步骤制备而成。

首先，本发明通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)合成水生拉恩氏菌的EPSP合酶基因AroA-Ra，该基因全长1284bp。即以EPSP合酶基因为模板，P27，P28为引物扩增EPSP合酶基因。回收EPSP合酶基因片段以DNase I缓冲液(50mmol/LTris-Cl pH7.4+1mmol/LMgCl2)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10％丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。进行Primerless PCR扩增。反应体系：5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/L dNTPs+4.5μl 25mmol/LMgCl₂+Taq2U+ddH₂O至50μl；反应程序为：94℃ 30s，40℃ 30s，72℃ 30s，共45个循环。

将无引物PCR扩增片段以P27，P28为引物进行PCR扩增。反应体系：5μl Primerless PCR产物+P27 0.2ng+P28 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH₂O至50μl。反应程序为：94℃ 30s，70℃ 30s，72℃ 2.0min，共35个循环，回收1284bp重排EPSP合酶基因片段，命名为EPSP合酶基因AroA-Ra。