[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测试纸条

说明书

技术领域

本发明属于动物免疫学检测技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析抗体检测试纸条，它包括一种特异单克隆抗体的制备与应用。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，简称PRRS)，又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种传染病，以成年猪早产、流产、死胎，仔猪呼吸障碍，以高热、高致病性和高死亡率为特征。近年来由于病毒不断变异，严重危害着世界养猪业的发展。 

本病诊断方法很多，根据临床症状及病理变化可以作出初步诊断，确诊必须依靠实验室诊断。抗体检测方法有间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清中和试验等。如专利公开号CN1525170“检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及用法”，提供了一种特异、敏感的间接ELISA抗体检测方法。但这些方法存在着各种不同的缺点，如需要专门的仪器、操作复杂、检测时间长、操作人员需经过专业培训、技术要求条件高，费用昂贵等。 

胶体金免疫层析技术是在免疫渗滤的基础上发展起来的一种快速检测方法，其原理是将胶体金标记蛋白或抗体涂覆于金标垫，于固相膜上包被抗体或蛋白，并与样品垫吸水垫组合到一起，制备胶体金免疫层析试纸条。该方法重复性好、灵敏度高，操作简单，结果快速准确、直观易辨，并可大量制备，工艺简单，生产成本低廉，适合基层及突发事件的大批量现场检测和流行病学调查。猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金抗原检测方法已有相关的的专利报道，如公开号CN101363865“一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用”、公开号CN201285399“检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条”。而有关胶体金抗体检测方法如公开号CN101363858“一种猪蓝耳病毒抗体胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用”，它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被猪蓝耳病毒N蛋白和抗猪蓝耳病毒的N蛋白多克隆抗体，但该专利文献并详细公开猪蓝耳病病毒的基因组序列，也没有提供扩增该病毒N蛋白的特异片段的核苷酸序列，同时没有提供其质粒载体的构建物理图谱和酶切位点，导致本领域的技术人员无法实施该发明并达到该发明所示的效果。另外，多克隆抗体不宜标准化，导致金标抗体包被条件需要反复摸索，也是该专利存在的一个缺点。 

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术的缺陷，利用构建的单克隆抗体制备猪繁殖与呼吸综合征胶体金免疫层析抗体检测试纸条，可用于快速、方便检测血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体。本发明的试纸条尤其适合不具备实验室条件的不发达国家的基层兽医站和防疫部门使用。 

本发明以间接法的原理，利用胶体金免疫层析技术及猪繁殖与呼吸综合征重组N蛋白和一种鼠抗猪IgG Fc单克隆抗体，制备了一种检测猪PRRSV抗体的胶体金免疫层析快速检测试纸条，其特点在于使用了一种鼠抗猪IgG Fc单克隆抗体，由于该单克隆抗体利用现有方法不可以重复获得，因此在申请日之前，申请人已将获得的分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株4F9送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了专利程序的保藏，其保藏日为2010年11月4日，保藏号为CCTCC NO：C2010105。从抗体的筛选上与上述专利文献报道的多克隆抗体的技术路线明显不同。 

本发明通过以下技术方案实施： 

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金抗体检测试纸条，由吸水垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、样品垫、PVC背衬板细装成，所述的玻璃纤维膜上结合有胶体金标记的鼠抗猪IgG Fc单克隆抗体。在所述的硝酸纤维素膜上的检测线部位划线包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白。在所述的质控线部位划线包被有兔抗鼠IgG抗体。所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白由原核表达制备获得(详细技术方案见实施例部分)。 

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金抗体检测试纸条的制备方法，其步骤包括： 

1)制备猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。利用现有方法不可重复获得兔抗鼠IgG抗体和鼠抗猪IgG Fc单克隆抗体，其保藏号为CCTCC NO：C2010105； 

2)样品垫及金标垫的准备：将玻璃纤维膜用已配好的封闭液浸湿，于37℃下过夜烘干；