[发明专利]一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达和纯化

说明书

技术领域

本发明涉及一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达和纯化，具体涉及一种来自极端嗜碱菌Bacillus halodurans C-125的β-葡萄糖苷酶基因及其合成、表达和纯化。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是一种能够水解碳水化合物之间糖苷键的水解酶(J Struct Biol 129：69-79)。酶学分类系统根据其氨基酸序列将β-葡萄糖苷酶分为两类：糖苷水解酶家族1(GHFl)和糖苷水解酶家族3(GHF3)。β-葡萄糖苷酶的应用范围很广，我们研究它的应用主要集中在它降解纤维素，木聚糖(Appl Environ Microbiol 68：1485-1490)以及植物产生的各种化合物(Mol Plant Microbe Interact 13：1041-1052)的功能。除此之外，还有它参与植物与病原菌之间的相互作用和其生物应用。众所周知，β-葡萄糖苷酶给工业生产方面带来了巨大的贡献。大量的β-葡萄糖苷酶的基因从动物(Enz Microbial Technol43：35-42)、植物(Bioresou Technol 99：6081-6087)和微生物(J Microbiol 47：542-548)中分离出来，进行了系统的研究。最近，来自于极端微生物体内的β-葡萄糖苷酶成为研究的热点，主要是因为这些酶可能具有潜在的特殊生物功能。

在NCBI数据库中，收集了很多微生物的全基因组信息，其中编码蛋白的序列都被注释了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注释蛋白的功能可以完善这些酶学，并运用到工业应用中去。

极端嗜碱菌Bacillus halodurans C-125是1977年首次被日本科学家分离出来的，并在2000年完成了基因组的测序(Nucleic Acids Res 28：4317-4331)。在过去的二十多年里，很多来自该碱性微生物中酶被分离出来并商业化了，其中含有半乳糖苷酶(Agri and Bio Chem 43：85-88)，木聚糖酶(J Bacteriol 161：784-785)，木糖酶(Appl Microbiol Biotechnol73：582-590)和乙酰酯酶(J Bacteriol 190：1375-1382)等。然而来自该菌的β-葡萄糖苷酶还从未研究过，也未见对该酶生理生化研究的报告。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种来自极端嗜碱菌的β-葡萄糖苷酶基因，所述的极端嗜碱菌为Bacillus halodurans C-125。

本发明所要解决的技术问题之二，在于提供一种所述β-葡萄糖苷酶基因的化学合成方法。

本发明所要解决的技术问题之三，在于提供一种所述β-葡萄糖苷酶基因在原核生物中的表达及其应用。

本发明的技术方案是通过以下方式来实现的。

本发明所述的β-葡萄糖苷酶基因，来自于极端嗜碱菌Bacillus halodurans C-125，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。

所述的β-葡萄糖苷酶基因是通过化学合成方法制备而成的。该方法采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成(PTDS)(Nucleic Acids Research，2004，32：e98)。即首先通过重叠延伸获得合成基因的片段，再通过最外侧的引物将全长的基因扩增得到目的基因。该方法一个明显的优势就是不需要对引物进行磷酸化处理。而且通过高通量的DNA合成仪器，可以较为便利地获得大量的引物。

所述的β-葡萄糖苷酶基因的合成方法，包括以下步骤：

1、引物设计

设计长度大概为60mer左右的覆盖整个β-葡萄糖苷酶基因的寡核苷酸的引物序列34个，且每相邻的两个寡核苷酸引物序列有20个碱基的重复。

利用PCR进行β-葡萄糖苷酶扩增，在100μl反应体系中，P2-P33共32个引物的添加量为2ng，外侧引物P1和P34添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得长度为1374bp的SEQ ID No 1序列的阳性克隆，即为本发明的β-葡萄糖苷酶基因。