[发明专利]一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一组鸡Cathelicidins抗菌肽，其特征是，其为鸡抗菌肽Cathelicidin1、鸡抗菌肽Cathelicidin2和鸡抗菌肽Cathelicidin3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.11所述。

2.如权利要求1所述的一组鸡Cathelicidins抗菌肽，其特征是，所述鸡抗菌肽Cathelicidin1、鸡抗菌肽Cathelicidin2和鸡抗菌肽Cathelicidin3，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.15所述。

3.如权利要求1或2所述的一组鸡Cathelicidins抗菌肽的制备方法，其特征是，所述制备方法为固相化学合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是将鸡抗菌肽Cathelicidin1、鸡抗菌肽Cathelicidin2和鸡抗菌肽Cathelicidin3的编码基因分别克隆到表达载体上，然后导入宿主细胞中表达；所述表达载体为质粒或病毒中的一种，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

4.如权利要求3所述的一组鸡Cathelicidins抗菌肽的制备方法，其特征是，所述基因工程方法为：

(1)将鸡抗菌肽Cathelicidin1、鸡抗菌肽Cathelicidin2和鸡抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的编码基因分别克隆到大肠杆菌融合表达载体pET30a(+)中，得到融合表达载体pET30-CathL1S、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S；

(2)将pET30-CathL1S、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，得到重组大肠杆菌基因工程菌株；

(3)37℃下，在LB培养基中，诱导物IPTG浓度为1.0mmol/L的条件下，对上述重组大肠杆菌基因工程菌进行诱导表达3小时；

(4)离心收集上述表达菌体，超声波破碎，分离细胞可溶组分与包涵体；

(5)Ni²⁺-NTA Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白。

5.如权利要求4所述的一组鸡Cathelicidins抗菌肽的制备方法，其特征是，

(1)PCR方法扩增编码鸡抗菌肽Cathelicidin1，2，3成熟肽的核苷酸序列，PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切后与同样酶切的pET-30a(+)融合表达载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，小量提取质粒，应用PCR和质粒酶切的方法筛选阳性克隆，通过DNA测序验证插入片段阅读框的正确性，从而构建出原核表达载体；将构建的融合表达载体分别命名为pET30-CathL1S、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S；

(2)将测序正确的质粒pET30-CathL1S、pET30-CathL2S、pET30-CathL3S分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，获得重组表达Cathelicidins1，2，3成熟肽融合蛋白的工程菌Rosetta(DE3)/pET30-CathL1S、Rosetta(DE3)/pET30-CathL2S和Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S；挑取工程菌单菌落接种至LB培养基中37℃培养8～12h；次日离心取菌体重悬至新鲜LB培养基中，待培养液OD_600nm值达到0.5～0.6时加入IPTG使其终浓度为1.0mmol/L，开始进行诱导；37℃继续培养4h，每隔1小时取样1mL；离心收集诱导培养后的菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，再加入裂解缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，每次破碎5s，间隔2s，功率600W，破碎10min；超声后12000r/min，4℃下离心10min，分离可溶组分与和包涵体，进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测；电泳后将SDS-PAGE凝胶中的条带电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗His单克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗，DAB为显色底物进行Western-blot分析，鉴定表达产物；

(3)然后进行工程菌扩大培养和目的蛋白的诱导表达，条件为：25℃、IPTG浓度为1.0mmol/L的条件下诱导培养8小时；取诱导后的菌体，加入结合缓冲液，冰浴中超声波破碎菌体，分离包涵体和可溶组分，将裂解上清液上样于Ni²⁺-NTA Sepharose 4B亲和层析柱，样品经含0.1～0.5mol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱，收集融合蛋白洗脱峰进行SDS-PAGE检测。