[发明专利]一种制备异戊二烯的重组细胞及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及异戊二烯化合物的制备领域，特别涉及利用重组细胞生物法制备异戊二烯的领域。

背景技术

异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95％用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。

目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。

生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。因此增加异戊二烯前体物质DMAPP的含量是提高异戊二烯产量的重要因素之一。

微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。

目前，随着分子生物学技术的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009)，但藻类生长缓慢、生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶颈问题。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而利用工程菌发酵生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。该工程菌中获得外源MVA途径时需要转入多达8个异源基因，由于过多的异源基因才表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱，影响细胞的正常生长代谢，最终导致目标产物产量低下。

发明内容

本发明提出利用可再生资源葡萄糖为原料，通过生物催化剂制备异戊二烯，建立可持续发展的异戊二烯合成工艺路线。

本发明主要通过基因工程手段提高甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径中限速酶活性(脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi))，增加异戊二烯的合成前体物DMAPP，再利用植物异戊二烯合成酶将DMAPP催化合成目标产物异戊二烯。最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种异戊二烯生物合成代谢途径。

本研究方法是利用大肠杆菌原有的MEP代谢途径，避免了由于过多外源基因的表达而导致细胞自身的代谢的影响，同时通过高效表达代谢途径的限速酶基因，优化MEP代谢途径，提高DMAPP的含量，组合植物的异戊二烯合成酶基因，最终在大肠杆菌中构建生物基异戊二烯合成途径。

更具体地，本发明提供以下各项：

1、一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括：在重组细胞体内，通过基因工程手段提高甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径中的3个限速酶(即脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶(idi))的活性，再通过表达外源的植物异戊二烯合成酶基因(IspS)合成异戊二烯的步骤。

2、根据第1项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶活性的提高是通过过表达内源或外源的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)实现的。

3、根据第2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)是来源于：1)埃希氏菌属大肠杆菌，或2)来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或3)和dxs基因同源性超过70％的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxs基因没有明显的同源性，但和dxs基因具有相同或相似功能的核酸序列。

4、根据第2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)是来源于：1)埃希氏菌属大肠杆菌，或2)来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或3)和dxr基因同源性超过70％的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxr基因没有明显的同源性，但和dxr基因具有相同或相似功能的核酸序列。