[发明专利]罗丹明B的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法

说明书

技术领域

罗丹明B的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法，具体涉及到免疫层析柱的的制备及实际样品检测，属于免疫学检测技术领域。

背景技术

近年来苏丹红，孔雀石绿事件给我国食品出口贸易带来很大问题，造成我方的很大被动。像苏丹红本为工业染料，而非食品添加色素。但一些不法商人为了牟取高额利润不顾消费者的健康问题，在食品中非法添加这些成本低、色彩鲜艳的工业染料。2008年卫生部发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》，明确规定苏丹红、碱性橙、酸性橙、罗丹明B类工业染料禁止在食品中添加。所以食品中违禁色素一直是食品安全检测的重点。目前对违禁色素的检测主要侧重在仪器分析，对免疫分析涉及很少。免疫分析基于抗原抗体免疫反应的特异性较于仪器分析其特异性强、灵敏度高，不仅可以大大简化甚至可以省去样品前处理的复杂过程，而且避免了因大量使用溶剂而对环境的污染，再而免疫分析一般不需贵重仪器，具便携性，不需要专门的技术人员，便于推广。因此对违禁色素的免疫分析研究是必不可少的。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有检测技术的缺陷，建立一种方便快速的样品处理方法，并在此基础上建立罗丹明B的检测方法。

本发明的技术方案：一种罗丹明B的免疫亲和柱-高效液相-质谱联用检测方法，以抗罗丹明B的抗体与四甲氧基硅烷TMOS偶联包埋于层析柱中，通过吸附、洗脱达到样品净化的效果，最后通过高效液相-质谱联用检测； 

1、罗丹明B免疫亲和柱的制备，步骤为：

（1）取0.2mL的0.04mol/L HCl溶液，0.75mL的去离子水，3.4mL的TMOS（四甲氧基硅烷）混匀。4℃保存2-3min；取出，超声粉碎30min；

（2）取一质量已知的烧杯，吸取20μL罗丹明B抗体溶液，用PBS（0.01mol/L、pH7.4)稀释至1mL，得罗丹明B抗体溶液，4℃保存。

（3）取步骤（1）超声完全后的混合液，吸取其中1mL试样，加入罗丹明B抗体溶液中，混匀，使之凝胶。

（4）待凝胶结束后，烧杯称重，置于37℃恒温烘箱凝胶老化，待凝胶失去初重的50%时，老化过程结束，将老化后的凝胶（约1g）研磨粉碎，装柱。

（5）待柱中凝胶沉积稳定后，用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS预淋洗，洗去未包埋的罗丹明B抗体和其他干扰杂质，最后用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS平衡，即制得罗丹明B的免疫亲和柱。

2、罗丹明B免疫亲和柱的吸附、洗脱：

平衡：10mL pH7.4、0.01mol/L的PBS；

上样：待测的样品溶液；

洗涤：用5mL pH7.4、0.01mol/L的PBS洗涤，再用5mL超纯水洗涤；

洗脱：5mL甲醇洗脱，收集洗脱液待测。

3、高效液相-质谱联用检测，步骤为：

（1）以一定水平的罗丹明B加入辣椒粉样品中，在室温下至少静置15 min；

（2）取上述添加罗丹明B的辣椒粉样品1g，加入10mL含体积百分20%丙酮的正己烷，震摇10 min，静置、过滤使分离出上层清液，残渣加入10mL含体积百分20%丙酮的正己烷重复提取一次，合并2次提取液，混匀；

（3）移取提取液于氮吹仪上吹干，用0.01M PBS重溶，吹干后的样品用0.01M PBS以质量计稀释10倍；

（4）用10mL 0.01M PBS平衡免疫亲和柱；

（5）加样，用5mL 0.01M PBS洗涤，再用5mL超纯水洗涤，洗去未吸附样品；

（6）5mL甲醇溶液洗脱柱上样品，收集洗脱液；

（7）洗脱液经0.22 μm孔径的聚四氟乙烯膜过滤后进行高效液相-质谱联用检测。

本发明的有益效果：本发明方法可以简化罗丹明B残留检测的样品处理过程，同时可达到净化浓缩的效果，成本低廉，快速，便携。

附图说明

图1罗丹明B标准溶液质谱标准曲线图。

具体实施方案

1、罗丹明B免疫亲和柱的制备：

（1）取0.2mL的0.04mol/LHCl溶液，0.75mL的去离子水，3.4mL的TMOS（四甲氧基硅烷）混匀。4°C保存2-3min；取出，超声粉碎30min；

（2）取一质量已知的烧杯，吸取20μL罗丹明B抗体溶液，用PBS（0.01mol/L、pH7.4)稀释至1mL，得罗丹明B抗体溶液，4°C保存。