[发明专利]一种抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗β-葡萄糖醛酸苷酶抗体，尤其涉及一种抗β-葡萄糖醛酸苷酶兔单克隆抗体的制备方法。

背景技术

gus基因是从细菌中获得的一类报告基因，能编码葡萄糖醛酸苷酶，该酶在组织化学染色中水解底物5-溴-4氯-3吲哚-葡萄糖醛酸苷，其水解产物呈蓝色。植株组织中不存在内源gus活性，用gus组织化学检测法检测转化愈伤组织或者再生植物切片，若呈现蓝色，就可以初步判断gus基因已转入到植株细胞并表达葡萄糖醛酸苷酶。gus基因就是β-葡萄糖醛酸苷酶基因，即β-gus。通过组织染色法只能初步判断gus基因是否已经转入到植株组织中基因中，因此这种方法对gus基因的判断会存在很大的误差，且其他干扰性较大。基因抗体与抗原之间特异性结合的免疫技术具有极高的灵敏度，当组织所表达出的β-葡萄糖醛酸苷酶极其微量时也能对其进行检测，且其他因素干扰性较小。因此开发能够与β-葡萄糖醛酸苷酶特异性结合的单克隆抗体具有极大的意义。

兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔比鼠能识别更多免疫抗原的表位抗原决定簇。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的细胞融合实验，使得高通量筛选阳性融合细胞成为可能。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法。

抗β-葡萄糖醛酸苷酶的兔单克隆抗体的制备方法,的步骤如下：

1)兔子免疫

将400~600μg的免疫抗原β-葡萄糖醛酸苷酶与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下3~6点注射2~3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用150~250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；

2)细胞融合

选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8~10天后取无菌脾脏，制备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为48％~52％的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为18%~22%的HAT作为选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为0.8×10^-6~1.2×10^-6mol/L的次黄嘌呤，A是浓度为3.5×10^-9~4.5×10^-9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1.4×10^-7~1.8×10^-7mol/L的胸腺嘧啶核苷；

3)杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后第8~12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15~19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到24孔培养板中传代培养一周；第22~26天通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3~5株生长状态最好且表达特异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子-20℃冻存，经重组获得的细胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。

本发明制备的抗β-葡萄糖醛酸苷酶兔单克隆抗体可用于ELISA、Western Blotting等免疫学手段对β-葡萄糖醛酸苷酶的定性或定量研究。

具体的实施方式

实施例1

1)兔子免疫

将400μg的免疫抗原β-葡萄糖醛酸苷酶与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下3点注射2只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用150~250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；

2)细胞融合