[发明专利]一种抗Cry1c晶体蛋白兔单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗Cry1c晶体蛋白抗体，尤其涉及一种抗Cry1c晶体蛋白兔单克隆抗体的制备方法。

背景技术

自1996年，第一例转基因食品——保鲜番茄在美国出现以来，转基因食品的研究与推广得到了全世界的广泛关注。人们对转基因的不断研究、吸收、推广使得转基因作物的多样性越趋丰富，同时转基因作物的种植面积也大幅增加。据农业生物技术应用国际服务组织（ISAAA）报道，全球共有144项转基因项目，代表24种作物得到了世界范围的认可，截止到2008年，全世界已经有25个国家种植转基因作物，同时另有30个国家允许进口转基因作物作为食品和种子。转基因作物中，尤以对Bt-Cry转基因蛋白的研究最多，Cry1c蛋白是Bt-Cry系列蛋白中的一种。目前转Bt-Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。

转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展，也促进了先进科学生产力的发展。转基因食品虽然能够满足人们对食品营养、产量、抗虫性、甚至药用价值等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物或者其衍生物中Cry1c蛋白进行快速的定量或定性分析，研究并得到一株抗Cry1c蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。

兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔比鼠能识别更多免疫抗原的表位抗原决定簇。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选阳性融合细胞成为可能。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗Cry1c晶体蛋白的兔单克隆抗体的制备方法。

抗Cry1c晶体蛋白的兔单克隆抗体的制备方法,的步骤如下：

1)兔子免疫

将400~600μg的免疫抗原Cry1c蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下3~6点注射2~3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用150~250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；

2)细胞融合

选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8~10天后取无菌脾脏，制备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为48％~52％的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为18%~22%的HAT作为选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为0.8×10^-6~1.2×10^-6mol/L的次黄嘌呤，A是浓度为3.5×10^-9~4.5×10^-9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1.4×10^-7~1.8×10^-7mol/L的胸腺嘧啶核苷；

3)杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后第8~12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15~19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到24孔培养板中传代培养一周；第22~26天通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3~5株生长状态最好且表达特异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子-20℃冻存，经重组获得的细胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。

本发明制备的抗Cry1c晶体蛋白兔单克隆抗体可用于ELISA、Western Blotting等免疫学手段对Cry1c蛋白的定性或定量研究。

具体的实施方式

实施例1

1)兔子免疫

将400μg的免疫抗原Cry1c蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下3点注射2只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用150~250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；

2)细胞融合