[发明专利]一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)主要引起母猪发热、流产，断奶前后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(LV)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。该病毒1996年传入中国并长期存在，成为危害我国养猪业的主要猪病病毒之一。

近年来，我国学者相继分离鉴定了美洲型PRRSV的CH-1a、S1、HB-1和HB-2等毒株。2006年6月份以来，我国多个省份的养猪场、户爆发猪“高热病”疫情，给养猪业造成了巨大的经济损失，中请人在研究该病的过程中，发现了其主要病原——高致病性PRRSV变异株，这一类的高致病性PRRSV变异株以Nsp2基因第1594～1680位核苷酸连续缺失为特征，并分离鉴定了代表性病毒株——NVDC-JXA1株(分类命名：繁殖与呼吸综合征病毒；保藏编号：CGMCC No.1964)。

2006年，申请人针NVDC-JXA1病毒株建立了特异性的RT-PCR检测方法，用于检测该病毒感染。但是2009年以来，通过在自然界中不断演化，我国高致病性PRRSV变异株已经在基因组序列上发生了一些变化；同时，由于CH1-R疫苗等毒株逐渐推广使用，对原有RT-PCR检测方法造成了非特异性的干扰。这些情况的出现，使得原有的RT-PCR检测方法和试剂盒已经不能有效地鉴别检测田间流行的高致病性PRRSV变异株。

本发明基于对2006年至2010年分离的多个高致病性PRRSV变异株基因序列分析，针对分离毒株Nsp2基因序列的共同特征，设计了一系列PCR 引物，并经过优化和试验筛选，获得了一对PCR引物。采用该引物组装的RT-PCR试剂盒，可以检测出当前发现的全部高致病性PRRSV变异株，并且不受经典PRRSV(是指Nsp2基因未发生第1594～1680位核苷酸连续缺失的毒株)和CH1-R疫苗毒株的干扰，从而能够特异、敏感地检测出高致病性PRRSV变异株。因此，该试剂盒能对高致病性PRRSV诊断和监测起到重要作用。

发明内容

本申请涉及针对高致病性PRRSV变异株NSP2基因片断设计的RT-PCR引物对，用于检测高致病性PRRSV变异株(本发明中特指Nsp2基因第1594～1680位核苷酸连续缺失为特征的毒株)。该引物对包括上游引物SEQ ID NO：1和下游引物SEQ ID NO：2的核苷酸序列为：

SEQ ID NO：1：5′-CGCAGAACAAAGTCTGTCAAAAG-3′

SEQ ID NO：2：5′-TGAGTCAGCGTTGCCTTCACAG-3′

本申请还提供一种能够特异、敏感地检测出高致病性PRRSV变异株的RT-PCR试剂盒，包含如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。试剂盒的其他组分均按照常规方法配制，具体为：

1.RNA提取试剂：由醋酸钠溶液350μl，酚/氯仿/异戊醇混合液3.5ml，异丙醇3.5ml，75％乙醇12ml，无菌DEPC水450μl，RNA酶抑制剂24μl组成。

2.RT-PCR反应试剂：由RT反应液200μl(含反转录引物序列：RT引物5’-TCgCCCTAAT-3’)、RNA酶抑制剂24μl、AMV反转录酶12μl、PCR反应液200μl、0.5U/μLTaq DNA聚合酶25μl、矿物油300μl组成。

3.电泳检测试剂：包括50×TAE电泳缓冲液20ml、溴化乙锭溶液100μl、上样缓冲液50μl。

4.阴性对照350μl、阳性对照350μl、变性液7ml。

附图说明

图1：SEQ ID NO：1

图2：SEQ ID NO：2