[发明专利]一种在酸性范围内催化活性提高的优化改良的大肠杆菌植酸酶APPA-M及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种在酸性范围内催化活性提高的优化改良的大肠杆菌植酸酶APPA-M及其基因和应用。 

背景技术

植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物机体必需矿物元素，单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸盐水解的酶)，造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低，为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费及严重的环境问题。 

国内外大量的实验都证明，在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷和其他矿质元素的利用率，提高对淀粉，脂肪，蛋白质等营养物质的利用率，从而促进动物健康快速的增长，减少粪便中磷含量从而减轻环境的污染。一般认为，在饲料中添加植酸酶可以使磷的利用率提高20-60％。Simons et al.(1990)，在玉米-豆粕日粮中添加微生物植酸酶，磷的利用率提高60％；Waldroup et al.(2000)，在以豆饼为基础日粮的肉鸡饲料中添加植酸酶，大约有50％的植酸磷被释放。 

随着生物技术的发展，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶基因的大规模表达成为可能。目前来源于Escherichia coli，Aspergillus niger、Aspergillus fumigatus等微生物的植酸酶已经在巴斯德毕赤酵母中得到高效表达，并成功的在饲料中应用。其中来源于大肠杆菌植酸酶APPA具有高比活性的优点，是目前应用的最为广泛的植酸酶。该基因全长1299bp，编码432个氨基酸，N端的22个氨基酸为信号肽。其最适温度为55到60℃，最适pH 4.5到5，在pH 2到3时，酶活性比较低，只有最适pH条件下的30-40％，不利于该植酸酶在胃环境中发挥水解植酸。 

动物饲养试验结果表明，饲料中添加的植酸酶水解植酸的主要部位因不同动物而异，猪主要在胃中，鸡主要在嗉囊中等。要提高猪饲料中植酸酶的水解活性，主要是要提高猪用植酸酶在胃环境下的植酸水解能力，其中提高植酸酶在酸性条件下 的稳定性和催化活性是重点。因此，优化大肠杆菌植酸酶APPA，使其在整个酸性范围内具有高催化活性，有较大的应用潜力和产业价值。 

发明内容

本发明的目的是通过对大肠杆菌植酸酶APPA的改造，使改造后的植酸酶APPA-M在整个酸性范围内具有高催化活性，使其能够更好的在动物胃内发挥水解植酸的作用。 

本发明的目的是提供一种优化改良的植酸酶APPA-M及其基因。 

本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组载体。 

本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组菌株。 

本发明的再一目的是提供上述植酸酶APPA-M的应用。 

本发明优选采用定点饱和基因突变的方法对大肠杆菌来源的植酸酶APPA活性中心的22个关键氨基酸进行改造，并经过高通量突变筛选的方法筛选得到在整个酸性范围内具有高催化活性的植酸酶APPA-M。本发明的植酸酶APPA-M和原有大肠杆菌植酸酶APPA相比，有两个氨基酸发生了突变，突变位点分别是M216C和N306D。突变后的氨基酸序列(不包括信号肽序列)如SEQ ID NO.1所示： 

qsepelklesvvivsrhgvraptkatqlmqdvtpdawptwpvklgwltprggeliaylghyqrqrlvadgllakkgcpqsgqvaiiadvdertrktgeafaaglapdcaitvhtqadtsspdplfnplktgvcqldnanvtdailsraggsiadftghrqtafrelervlnfpqsnlclkrekqdescsltqalpselkvsadnvsltgavslasClteifllqqaqgmpepgwgritdshqwntllslhnaqfyllqrtpevarsratplldliktaltphppqkqaygvtlptsvlfiaghdtDlanlggalelnwtlpgqpdntppggelvferwrrlsdnsqwiqvslvfqtlqqmrdktplsIntppgevkltlagceernaqgmcslagftqivnearipacsl