[发明专利]一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测及生物技术领域，具体涉及一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的制备方法及应用。

背景技术

由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，Schw）引起的小麦赤霉病是一个世界范围内的病害，不仅造成严重的产量损失，而且病麦粒残留的真菌毒素严重威胁人畜的健康。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON），是一种单端孢霉烯族毒素，是禾谷镰刀菌产生的最重要的有毒代谢产物，主要污染小麦、玉米等谷物及其制品，不仅具有致动物呕吐等急性毒素性、生殖毒性、免疫毒性，而且也是我国恶性肿瘤高发区居民粮食优势污染霉菌毒素之一。因此，及时对食品及其原料中的真菌毒素进行检测，防止真菌毒素(如DON)污染的食品进入食物链，是预防真菌毒素对人和动物带来危害的重要手段。

薄层层析法(TLC)、高效液相法(HPLC)、气相色谱法(GC)曾广泛应用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的定量检测，但这些方法在检测过程中需要使用大量的有机溶剂、贵重的设备和繁杂的样品净化，比较昂贵和耗时，不适用于数量较多样品的检测。免疫学检测法，其原理是在成功制备DON免疫抗体的基础上，利用间接酶联免疫检测法（ELISA）来测样品中DON的含量，该方法具有高选择性、灵敏、快速、一次可检测多个样品、对样品的纯度要求不高、操作简单等特点，是目前DON检测的的较好方法。DON是小分子半抗原，其分子量为296.3，结构简单，必须首先将其同大分子蛋白相偶联，合成DON人工抗原，才能保证DON抗原的有效包被。

关于DON人工抗原合成的策略己有多种报道。1986年Zhang等首次建立了DON的免疫检测方法，通过将DON乙酰化，合成了含三个乙酰基的DON (Tri-Ac-DON)，但测定过程比较烦琐，且准确性差。1988年Casale等在制备复合抗原的过程中，先将C7和C15上的羟基用丁基硼酸进行封闭，形成环状内酯，然后经高温反应将C3位上的羟基转变成羧基，再与载体蛋白进行共价结合，最后去除环状内酯物质。1990年Mills等人又采用一种新的半抗原衍生法，即用戊二酸酐与3-Ac-DON反应得到3-Ac-DON-Hemiglutarate。然后，利用乙酰脂酶(Acetyl esterase)水解掉C3上的乙酰基，生成DON-Hemiglutarate，再与BSA偶联，得到所需抗原DON-HG-BSA。该方法的不足之处是3-Ac-DON和乙酰脂酶非常昂贵。

发明内容

本发明需要解决的问题是：提供有效而容易获得的方法制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇的人工抗原，使之可以用于人工抗原的免疫学分析。

本发明的技术方案为：1. 采用丁基硼酸封闭脱氧雪腐镰刀菌烯醇C7和C15上的羟基，形成环状内酯DON-BBA。2. 用戊二酸酐同C3上的羟基发生酰化反应，形成BBA-DON-HG，并用甲醇解封闭，形成3-HG-DON。3. 用DCC方法将3-HG-DON与BSA载体蛋白偶联，得到人工抗原DON-HG-BSA。

1. 采用丁基硼酸封闭脱氧雪腐镰刀菌烯醇C7和C15上的羟基，形成环状内酯DON-BBA；

a) 将脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶解于无水四氢呋喃后与丁基硼酸混合，脱氧雪腐镰刀菌烯醇与丁基硼酸的物质的量比为：1：8~10，脱氧雪腐镰刀菌烯醇与无水四氢呋喃的体积比为：0.01~ 0.02（g/mL）；

b) 室温振荡反应12-16小时，以薄层色谱TLC检测监控反应程度，直至DON封闭完全，形成DON-BBA。

2. 用戊二酸酐同C3上的羟基发生酰化反应，形成BBA-DON-HG，并用甲醇解封闭，形成3-HG-DON；

a) 将DON-BBA与4-二甲氨基吡啶 (溶于无水四氢呋喃)和戊二酸酐 (溶于无水四氢呋喃)混合，DON-BBA与DMAP和HG的物质的量比为：1：2~4：6~9，4-二甲氨基吡啶与无水四氢呋喃的体积比为1：0.1~0.2（g/mL），戊二酸酐与无水四氢呋喃的体积比为1：0.1~0.2（g/mL）；

b) 37℃振荡反应2小时后加入蒸馏水400~500μl终止反应，抽真空除去四氢呋喃；

c) 氯仿萃取3~4次，合并氯仿相，抽真空去除氯仿；

d) 将残留物溶于700~ 800μl甲醇，室温振荡反应(解封闭) 12~16小时；

e) 薄层层析纯化3-HG-DON(展层剂为氯仿：丙酮：异丙醇=8:1:1)，紫外光下剖取Rf值小于DON的条带，甲醇洗脱收集，真空干燥得3-HG-DON。