[发明专利]一种检测人肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫分析技术领域中的一种检测人肿瘤坏死因子-α的酶联免疫试剂盒

背景技术

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)主要由单核细胞和巨噬细胞产生，包括膜结合前体蛋白和可溶性蛋白两种形式。膜结合前体蛋白包括35个氨基酸组成的胞内区，21个氨基酸的跨膜部分，以及177个氨基酸的胞外区共三个部分。可溶性TNF由膜结合前体蛋白胞外区酶切后释放，并形成具有生物学活性的同源三聚体，分子量为17kDa，每个亚单位包含157个氨基酸残基。TNF-α通过与细胞表面的TNFI型和II型受体结合发挥作用，是一种具有广泛生物学作用的细胞因子，如可以刺激巨噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞分泌多种细胞因子和介质，促进炎症反应，引起组织损伤和中毒性休克；能够抑制病毒并对病毒感染的细胞具有杀伤作用；通过调控细胞增值，分化和凋亡，影响淋巴组织发育；调控造血干细胞的分化等。

临床研究发现，TNF由于能够上调炎症反应，因此是内毒素诱发的感染性休克的重要介导物质。同时，TNF又称恶液素，可诱发肿瘤病人发生恶液质，主要表现为进行性体重下降，食欲减退和顽固性机体消耗，导致肿瘤患者死亡率升高。另外，TNF还与多种临床疾病密切相关，如在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染时，血清中TNF可升高，而且与脑部病变的严重程度相关；人骨髓移植后，如果TNF水平升高，常有合并症发生；TNF可能还是急性肝坏死形成的重要因素。与TNF相关的其它疾病还包括哮喘、II型糖尿病以及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。

TNF、TNF抗体及TNF拮抗剂目前均有上市药品用于临床治疗。其中由于TNF在免疫反应中具有重要的作用，因此抗TNF抗体及TNF拮抗剂目前已经被批准广泛应用于自身免疫性疾病，如克罗恩病、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎，效果明显。同时，在TNF的众多生物学功能中，它的抑瘤作用尤为受到关注，大量实验研究证实TNF对部分肿瘤细胞具有明显的细胞毒和抑制生长的作用，但由于天然TNF的毒副作用较大，因此严重限制了其临床应用，需要研发出高效低毒的改构重组TNF。

TNF-α作为免疫学研究的重要生物学指标之一，涉及感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等多种疾病的发生机理、预后判断和临床治疗，因此建立简单易行的定量方法，准确测定不同样本中的TNF水平对于基础及临床研究均具有重要的意义。酶联免疫法由于检测设备要求低，易于实现快速高通量，定量较为准确，因此是目前测定可溶性TNF的主要手段，本发明完全自主开发出了新型鼠抗TNF单克隆抗体和兔抗TNF多克隆抗体，采用双抗夹心法组成了TNF检测试剂盒，可以被广泛应用于TNF的基础及临床研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、准确性强、低成本的人TNF-α双抗夹心法检测试剂盒。

本发明所提供的检测试剂盒包括特异性的TNF-α包被抗体，酶标TNF-α检测抗体以及人TNF-α蛋白标准品。

其中所述TNF-α包被抗体为单克隆抗体，所述酶标TNF-α检测抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体可以为鼠源或兔源抗体，所述多克隆抗体可以为兔源、羊源、马源抗体，所述包被用单克隆抗体优选为鼠单克隆抗体，其轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，所述酶标检测抗体优选为兔多克隆抗体。所述人TNF-α蛋白标准品为大肠杆菌表达的具有生物活性的重组人TNF-α蛋白。

所述单克隆抗体采用重组人TNF-α蛋白免疫动物，利用杂交瘤技术制备获得。所述多克隆抗体采用重组人TNF-α蛋白免疫动物，通过蛋白A纯化和抗原亲和纯化技术制备获得。酶标抗体按照常规方法利用辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记抗体获得。所述重组人TNF-α蛋白是经大肠杆菌表达后纯化获得。

本发明的技术方案为优选具有高灵敏度、高特异性的单克隆抗体与酶标多克隆抗体配对组合，将单克隆抗体作为包被抗体吸附于固相载体上，包被抗体可以特异性的捕获样本中的TNF-α以及TNF-α蛋白标准品，加入酶标检测抗体后，形成包被抗体、抗原、检测抗体复合物，相应底物显色后终止，读取样本吸光值，通过与标准曲线比较即可得出TNF-α的含量。