[发明专利]利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程单链抗体检测海洋毒素的检测试剂盒，更具体地涉及了利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素(μ-Conotoxin, μ-CTX) 的试剂盒，进一步涉及使用该试剂盒检测μ-CTX的方法。

背景技术

芋螺毒素（Conotoxin ，CTX）是由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺（Conus）分泌出来的，用于麻醉猎物的小肽类毒素。μ-CTX与河豚毒素相似，是典型的钠离子通道抑制剂，中毒者出现肢体麻木、瘫痪等症状，严重的可导致死亡。常用的检测方法有高效液相色谱/四极杆-飞行时间质谱（HPLC/Q-TQFMS）联用技术，但是花费大、耗时、可变性高、灵敏度低、受待检样品量的限制、不能对特定毒素提供确定性的证据，现阶段缺乏一种简单有效的检测μ-CTX的方法。

发明内容

本发明提供了一种简单、有效的利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素的试剂盒。

本发明的技术方案如下：

本发明的利用基因工程单链抗体检测μ-芋螺毒素的试剂盒，其试剂包括：

（1）样品提取液：去离子水；

（2）标准试剂：TRX-CTX毒素；

（3）酶标抗原试剂：为含TRX-CTX-HRP 偶联蛋白的0.01M 、pH为7.4的PBS溶液，保存于50%（体积比）的甘油内，-20℃保存，效价为5000；

（4）洗涤液：TNT溶液；配方组份：0.05％（体积比）吐温-20，20 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.4；

（5）BSA试剂：含5% （重量比）BSA的TNT溶液；

（6）显色底物：10 ml显色液；配方组份： 250 μL 20 mg/mL DAB，40 μL 40 mg/mL NiCl，9.75 ml 的1.0 mol/L、pH 6.8 的Tris-HCl，-20℃保存；使用时加7 μL 30％（体积比）H₂O₂；

（7）终止液：去离子水中含：0．1 mol／L亚硫酸钠，2 mol／L硫酸。

利用所述试剂盒检测μ-芋螺毒素的方法，依次包括以下步骤：

（1）样品处理：在1g样品中加入4ml样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取10 min，5000rpm离心10 min，上清液即为含样品的样品提取液；

含样品的样品提取液取100 μl与100 μl酶标抗原试剂混和均匀，即成A试剂；

            系列浓度的TRX-CTX毒素标准试剂0.01，0.1，1.0， 10 ng/mL各100 μL 分别与100 μL 酶标抗原试剂混和均匀，即成系列浓度的B试剂；

（2）试剂平衡：将试剂盒自-20℃冰箱取出，放置15 min以上，平衡至室温；

（3）小孔编号：取出酶标条放置在反应板支架上，标记1号孔为阴性孔，2－5号孔为TRX-CTX毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已固相化抗μ-CTX单链抗体；

（4）洗涤：每孔加入250 μL洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2min后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板一次；

（5）加样：1号孔加上50 μL BSA试剂，2－6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μL，每个样品孔内加入A试剂50 μL，轻轻震荡，使各孔内试剂混匀；

（6）反应：将反应板放入37 ℃恒温箱中孵育30 min；

（7）洗涤：取出反应板，去掉步骤（5）所加试剂，拍干，每孔加入250 μL洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2 min后，弃去洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；

（8）显色：每孔加入显色底物100 μL，摇匀，将酶标板放入37 ℃恒温箱中存放15 min；

（9）终止与仪器测定：每孔分别加入终止液50 μL，然后用酶标仪在450 nm处测定各孔内物质的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线得到样品中μ-CTX的浓度，根据计算公式μ- CTX含量(ng/g)＝C*V / m，其中C为μ- CTX的浓度，ng/mL；V-样品提取液的体积，mL；m-样品质量，g；计算样品中μ-CTX的含量。

所述抗μ-CTX单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。