[发明专利]α-葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种α-葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法。

背景技术

α-葡聚糖(Dextran)是一种完全由葡萄糖单体组成的多糖，分子式(C₆H₁₀O₅)_n，分子量一般在几万至几百万之间，通常为白色的无定形粉末固体，呈胶粘状，粘度随分子量和浓度的增加而增加，无臭无味，易溶于水，溶解性随分子量的增加而下降。在常温、中性溶液中可稳定存在，遇强酸分解，在碱性溶液中其端基易被氧化，受热时可逐渐变色或分解。

α-葡聚糖对制糖工业的危害有以下几个方面：（1）造成糖分损失，减少收回率；（2）使糖液的粘度增加；（3）使转光度测定结果偏高；（4）使糖液的粘度增大；（5）使蔗糖结晶时晶体生长变形；(6)大大降低制糖生产的效率。

1959年，Nicholson和Horsley首次报道了Haze法测定制糖过程中的α-葡聚糖，这种方法是在样本中加入酒精使α-葡聚糖沉淀，然后利用分光光度计测量所产生的浊度。ICUMSA第16届会议上讨论了采用50%酒精以保证α-葡聚糖完全沉淀，又避免过高酒精度下其它多糖沉淀的可能（CSRHaze法），在第17届会议上被列为试行方法，当时命名为：“原糖中类α-葡聚糖的Haze法”。此方法须在加入酒精前除去淀粉、蛋白质、脂肪、无机盐等在50%酒精中不溶解的非α-葡聚糖物质，前处理比较麻烦。该方法作为ICUMSA的试行方法一直到1986年才被取消。

1984年周重吉和Wnukowski对Haze法进行了改进，主要是化验结果用MAU（千分之一吸光度单位）取代CRSHaze的ppm（百万分之一吸光度单位），这样可以避免作标准曲线时所涉及的α-葡聚糖相对分子质量的问题。此方法被原糖贸易契约所采用，由于Haze法的测定结果随着用来标定的α-葡聚糖相对分子质量的改变而变化，Amstar契约法不用标准曲线，而以浊度或Haze（模糊度）作为结果，其单位是MAU，在酒精沉淀前使用大量的离子交换树脂、微孔过滤器，使用无水酒精。

罗伯特法是用80%的酒精分离糖液中所有的多糖，然后再用碱式硫酸铜处理这些收集到的多糖，通过形成铜-α-葡聚糖络合物而分离出α-葡聚糖。用硫酸水解分离的α-葡聚糖，所得的α-葡聚糖与苯酚显色，再通过分光光度法测定。据ICUMSA报道，对于α-葡聚糖含量在300mg/L以上的原糖，CSRHaze法和罗伯特法的重复性和再现性在含α-葡聚糖相当的水平上是一致的。

近年来，在寻找更准确、更快捷的α-葡聚糖检测方法方面已经开展了大量的研究。出现了酶水解法、SPRI快速扫描检验法和免疫分析法等新方法。

美国糖业研究院的Brown和Inkerman研究出用酶法测定还原糖中α-葡聚糖含量的定量分析法。首先用80%的酒精沉淀α-葡聚糖，然后用α-葡聚糖酶进行水解，所得的主要产物异麦芽糖（Isomaltose）用HPLC检测，根据异麦芽糖的含量可计算出α-葡聚糖的含量。该方法所需时间较长，并且α-葡聚糖酶较贵，不适于常规检验。Richard和Storkee的酶解法采用专一的α-葡聚糖酶，但该酶只能切断直链（1，6）键，对支链（1，2），（1，3），（1，4）键不起作用，同时酶解后的短链分子很难通过渗透膜。

英国旋光仪器公司(OPTICALACTIVITY)与伦敦的Westminster大学和牙买加的糖业研究所合作开发了一种新的近红外旋光测定仪，使用了专用的酶，能分解α-葡聚糖，用近红外旋光仪测定其旋光度的变化，可精确测量甘蔗样品中的α-葡聚糖。但目前专用的α-葡聚糖酶和近红外旋光仪都较贵，还不适用于常规检验。

澳大利亚的Curtin曾尝试过用免疫分析法对α-葡聚糖进行分析。免疫分析法的操作步骤是根据抗体和抗原发生反应生成络合物制定的。免疫法具有操作简单，灵敏度高，不需要特殊仪器和设备等优点，特别适合测定甘蔗的α-葡聚糖，目前正在研究将这种方法用在常规检验中。但目前只有美国米兰公司（Midland）等能制备α-葡聚糖特异性单克隆抗体，且价格昂贵，需进一步研究低成本、高效价抗体的制备技术。

美国Clarke等研究出SPRI快速扫描检验法，也称为Tilbury修订法。这种扫描法可在5min内完成检验，因此这种测定方法耗时少，从而避免了由于时间、温度等因素对样品中α-葡聚糖含量的变化的影响，还具有操作简单，不需要特殊仪器和设备等优点，适合于用在对甘蔗和蔗汁的常规检验中。此法相对快速，但前处理过程不可避免，且所测结果包括所有多糖,使结果偏高。