[发明专利]含碳酸钙的石油污染土壤修复用固定化微球、制法及应用

权利要求书

1.一种含碳酸钙的石油污染土壤修复用固定化微球，其特征在于：颗粒呈圆球状，内部有空隙，其微球直径为2.5～3.0mm，所述固定化微球颗粒包含海藻酸钠作为包埋材料，固体碳酸钙作为成孔剂和缓释剂，凹凸棒土作为吸附剂，其吸附有石油烃降解菌及营养元素。

2.如权利要求1所述的固定化微球，其特征在于，所述海藻酸钠、凹凸棒土和碳酸钙的质量比例为1-6∶0.5-3∶1-10，优选比例为2.5-3.5∶0.5-1.5∶3-7，更优选3∶1∶5。

3.一种含碳酸钙的石油污染土壤修复用固定化微球的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)培养并配制石油烃降解菌的菌悬液；

(2)将海藻酸钠与凹凸棒土混合均匀后放入去离子水，高温湿热灭菌，保持40-60℃，将固体碳酸钙投入海藻酸钠-凹凸棒土混合物中，混合均匀，继续保持40-60℃，得到海藻酸钠-凹凸棒土-碳酸钙凝胶；

(3)将步骤(1)所得菌悬液加入到步骤(2)所得凝胶液中，混合均匀；混合物中，石油烃降解菌的浓度优选为0.01-0.04g/ml，最优选0.02g/ml；海藻酸钠的浓度优选为0.01-0.06g/ml，进一步优选0.025-0.035g/ml，最优选0.03g/ml；凹凸棒土的浓度优选为0.005-0.03g/ml，进一步优选0.005-0.015g/ml，最优选0.01g/ml；固体碳酸钙的浓度优选为0.01-0.1g/ml，进一步优选0.03-0.07g/ml，最优选0.05g/ml；

(4)将步骤(3)所得混合物，滴加入氯化钙溶液中，快速均匀混合，得到球型颗粒；其中氯化钙溶液的浓度优选为0.02-0.08g/ml，进一步优选0.02-0.04g/ml，最优选0.02g/ml；

(5)在步骤(4)球型颗粒成球5-30min后，收集球型颗粒，置于稀盐酸中反应，直至无明显气泡产生，清洗；

(6)将步骤(5)所得颗粒置于氯化钙溶液中，浸泡，清洗；

(7)将步骤(6)所得颗粒转移入增殖培养基中，摇床培养，清洗，即制备得到固定化微球。

4.如权利要求3所述的固定化微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)与氯化钙混合时，石油烃降解菌、海藻酸钠、凹凸棒土、碳酸钙和氯化钙的浓度比＝1-4∶1-6∶0.5-3∶1-10∶2-8，优选1-4∶2.5-3.5∶0.5-1.5∶3-7∶2-4，更优选2∶3∶1∶5∶2。

5.如权利要求3或4所述的固定化微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述菌悬液的溶剂为增殖培养基，其成分为：葡萄糖20g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨2g/L，NH₄NO₃1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KCl 0.2g/L，其中该增殖培养基的pH＝7.8。

6.如权利要求5所述的固定化微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)培养并配制石油烃降解菌的菌悬液的步骤为：

A配制LB液体培养基，高温灭菌，冷却至室温，获得富集培养基；

配制增殖培养基，高温灭菌，冷却保存；

B在无菌操作台中，在步骤A所得富集培养基中按5％的接种量接种石油烃降解菌，然后，于25℃-30℃恒温摇床振动培养，收集菌液，离心得到湿菌体；

C将湿菌体与增殖培养基混合均匀。

7.如权利要求3-6任一项所述的固定化微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)利用恒流泵滴加所述混合物至所述氯化钙溶液中。

8.一种含碳酸钙的石油污染土壤修复用固定化微球产品，通过权利要求3-7任一项所述的固定化微球的制备方法制备得到。

9.如权利要求1或2或8所述的固定化微球或权利要求3-7任一项所述的固定化微球的制备方法，其特征在于，所述固定化微球包埋的耐低温石油烃降解菌为Paracoccus sp.D17或Paracoccus sp.D24。

10.权利要求1或2所述固定化微球用于降解石油烃的应用，优选用于在土壤中降解石油烃的应用。