[发明专利]HRN/gpt delta转基因小鼠模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型的构建方法，具体而言，涉及一种肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta（HRN/gpt delta）转基因小鼠模型的构建方法。

背景技术

机体代谢过程对外源化合物既可解毒也可增毒，且与化合物对机体的致癌作用密切相关。肝脏细胞色素P450酶（缩写为CYP）在机体对外源性化合物的代谢过程中起到重要作用，但可用于揭示其致癌作用的研究工具非常有限。

目前，研究肝脏P450酶对外源性化合物的代谢主要集中在体外实验上，包括肝脏微粒体、原代肝细胞、CYPs各亚型高表达细胞株和重组酶的应用。尽管这些体外方法具有很大应用价值，但是，由于外源性化合物的摄入途径不同、组织中有机阴（阳）离子转运体的存在、肾脏清除作用和肝外CYPs作用等复杂因素的存在，使得上述体外实验仍然难以精确预测外源性化合物在体内的实际代谢途径（Friedberg T, Pritchard MP, Bandera M, Hanlon SP, Yao D, McLaughlin LA, Ding S, Burchell B, Wolf CR. Merits and limitations of recombinant models for the study of human P450-mediated drug metabolism and toxicity: an intralaboratory comparison. Drug Metab Rev. 1999.31(2):523-44.）。在体内代谢研究中，目前已有多个P450酶亚型敲除小鼠模型，这些模型已被广泛用来研究特异性P450酶亚型在外源性化合物的代谢和毒性中的作用。然而，CYP通常具有多种亚型，并且各亚型功能类似，底物存在交叉，使得单一亚型的基因敲除动物模型难以准确评价P450酶对外源性化合物毒性的影响。因此，使所有CYPs都失去功能的模型将是一个非常有用的工具。NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR/POR）为所有微粒体P450酶的氧化还原搭档，它提供P450酶氧化还原反应所需的第一个电子，基于此原理，Jun Gu等人开发了一个肝脏特异性P450还原酶-Cpr基因敲除小鼠模型（Hepatic Reductase Null，HRN,以下简称为肝脏特异性CPR KO小鼠模型），该基因表达的缺失将抑制所有肝脏P450酶的活性（Wu L, Gu J, Weng Y, Kluetzman K, Swiatek P, Behr M, Zhang QY, Zhuo X, Xie Q, Ding X. Genesis. 2003 Aug;36(4):177-81.）。该模型利用Cre/LoxP系统通过条件敲除（conditional knock）获得，小鼠在成熟过程中肝脏Cpr基因被逐渐敲除（出生2个月以后），最终使得肝脏P450酶活性丧失，而其他组织却不受影响。

绝大多数致癌物具有遗传毒性，即损伤遗传物质(DNA或染色体)，引起基因突变进而致癌。遗传毒性的评价是预测致癌性的有效方法，其检测的对象包括DNA损伤及DNA损伤引起的基因突变、染色体损伤、重组和数目的改变等。评价通常采用标准组合试验进行，如评价DNA损伤的彗星试验、评价染色体损伤的微核试验和染色体畸变试验、评价基因突变的Ames试验、哺乳动物细胞基因突变试验和转基因动物突变检测试验等。与体外实验相比，体内实验方法假阳性发生率较低，并且具有考虑到与人体应用相关的吸收、代谢、分布和排泄的优点，因此体内实验的应用日益受到重视。现有的体内试验方法较少，经典的体内微核试验可预测致癌性，但是该方法只评价骨髓而不能预测毒性靶器官。转基因动物是一个非常重要的研究工具，可检测任何所需器官内的基因突变，还可以进行突变的机制分析。