[发明专利]用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法。

背景技术

诺沃克类病毒感染是一种由诺沃克类病毒所引起的传染病。此病毒会引致食物中毒或肠胃炎，是很多国家非细菌性胃肠炎的最主要致病原，而且容易在安老院及学校引致病症爆发。除此之外，任何年龄的人士均有机会染上此病，多发于冬季。

以往检测诺沃克类病毒的主要办法：聚合酶链式反应法(PCR法)，该法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未有用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒试剂盒及方法的报道。

发明内容

为了解决现有技术所存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法，通过使用该试剂，能快速、特异性强、灵敏度高且成本低的用环介导等温扩增(Loop—mediated isothermal amplification，LAMP)方法检测诺沃克类病毒的试剂盒，并提供一种使用该试剂盒快速检测诺沃克类病毒的方法，该技术将会在遗传和传染病的早期诊断及预防控制方面发挥重要作用。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成；在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法，该试剂盒包括：

环介导等温扩增反应液A：

含有10X Thermopol反应缓冲液、300－500uM dNTP、2－4mM硫酸镁、0.8－1.2uM上游内引物、0.8－1.2uM下游内引物、0.2－0.3uM上游外引物、0.2－0.3uM下游外引物；

其中10X Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷一盐酸、l00mM氯化钾、l00mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X－100；

其中，上游内引物为：

GAGATYGCGRTCYCCTGTCCATTTTGVTGGCAGGCCATGTTCCG；

AGATTGCGATCGCCCTCCCATTTTGCCCAGACAAGARSCMATGTT；

CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTTGGATTTTTACGTGCCMAGRCA；

CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTCATGAGTTTTATGTGCCAAAGT；

下游内引物为：

TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTRCCTCYGGTACYAGCTGGC；

TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTTAACCTCCGGYACSAGYTGA；

TGDGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTTGRCCTCTGGKACGAGGTT；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTYYTCTGGGACGAGRCMGGC；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGACCTCATTATTACTTTCTGGC；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTCWTTKTKRMYCTCTGGKACGA；

TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGYCTCAKTATTRCTYTCTGGC；

上游外引物为：

GGTTTRGARATGTATGTSCCA；

AAGGGGGSYTTGARATSTAC；

GAAGGTGGCATGGAYTTTTA；

AGTGGTGGTCTGGARTTTTA；

ACWGARYTSAARGARGGTGG；

GGCATGGTWATCAAAGAAG；

GAGATYAAGAGTGGTGGTC；

下游外引物为：