[发明专利]单链非编码MicroRNA二及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种MicroRNA的乙肝重症病人血浆中的表达水平及其在预测和诊断乙型肝炎重症化中的作用。

背景技术

目前全球估计有3.5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者，有三分之一的人口感染过HBV。在我国，乙型肝炎是最为严重、最广泛的传染病之一，感染率高达60％，约有1.2亿人携带HBV。乙型肝炎的发病率居传染病首位，死亡数居传染病第三位。

乙肝重型肝炎是一类表现为短期大量肝细胞坏死导致肝功能衰竭的综合症，其死亡率极高，发展迅速，凶险而且临床预后差。并严重威胁人们身体健康的肝疾病，因此，早期诊断，以便及时采取有效的治疗措施尤其重要。

MicroRNA是由机体内源基因转录的约70nt的发夹状结构前体(pre-MicroRNA)被Dicer酶切割后产生的约22nt的非编码单链RNA片段，在进化过程中高度保守，能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，广泛地负调控靶基因的表达。MicroRNA作为一种新的基因干预工具，具有高效、特异、快速等优点，为基因调控的研究和基因治疗的发展带来了新的视角。MicroRNA非常稳定，用于临床诊断试剂的研发具有重复性好、容易操作等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用单链非编码MicroRNA 501-5P制备诊断试剂盒以诊断重症肝炎。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种单链非编码，单链非编码MicroRNA 501-5P为SEQ ID NO：1所示的序列。

本发明还同时提供了上述单链非编码MicroRNA在制备诊断乙型重症肝炎的试剂盒中的应用。

本发明还同时提供了一种用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒，包括PCR试剂、探针、上游引物和下游引物；探针为SEQ ID NO：5所示的序列，上游引物为SEQ ID NO：3所示的序列，下游引物为SEQ ID NO：4所示的序列。

作为本发明的用于诊断乙型重症肝炎的试剂盒的改进：PCR试剂为1×TaqManUniversal PCR MasteMix。

MicroRNA是一类高度保守的单链RNA(约22个核苷酸)，生物信息学分析表明，每个microRNA可能调节数百个靶基因，提示microRNA可能参与调节细胞生命活动中众多的信号转导途径，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应及血管生成等一系列过程中发挥作用。另外，MicroRNA的异常表达将会导致生理的异常和疾病的产生，相反疾病的产生也将导致MicroRNA的表达水平的改变，人们可以利用它来反映疾病的程度并做出相应的治疗。

MicroRNA序列测定相对简单，通过基因工程技术可以比较容易地分离纯化人类外周血中存在的MicroRNA，并对其进行测序。到目前为止已经报道了超过800个MicroRNA序列，但是由于MicroRNA功能的复杂性，大部分MicroRNA的功能和用途仍属未知，因此，寻找和开发有用的MicroRNA用于临床诊断和治疗是当前研究热点。美国应用生物系统公司根据目前的研究现状研发了MicroRNA芯片(TaqMan MicroRNA Arrays)，它包含大部分已知的MicroRNA的反转录引物，利用该芯片可以检测出已知序列的这些MicroRNA表达水平的变化情况。本发明利用该芯片对乙型肝炎重症患者血浆中MicroRNA进行检测，以正常人为对照，对患者作一个比较全面的MicroRNA图谱，从中找出与乙型肝炎重症化病情变化密切相关的MicroRNA分子。利用该分子可研发预测和诊断肝炎重症化诊断试剂。

在本发明中，发明人通过检测乙型肝炎重症患者血浆中MicroRNA501-5P的表达水平，观察乙型肝炎重症状态下MicroRNA的改变情况。本发明选取正常人和已被确诊为乙型肝炎重症患者的血浆，从血浆中提取RNA，利用MicroRNA表达谱芯片(美国应用生物系统公司MicroRNA Array A(B))对MicroRNA进行分析。结果发现，MicroRNA 501-5P在乙型肝炎重症患者血浆中显著上调，即，该MicroRNA在乙型肝炎重症患者血浆中表达较正常人明显增高。提示MicroRNA501-5P在乙型肝炎重症化中起着重要的调控作用，同时该MicroRNA可以作为乙型肝炎重症化的诊断标志物。

采用本发明的方法来早期诊断乙型肝炎重症化，具有如下优点：

本发明确认了MicroRNA 501-5P作为诊断乙肝重型肝炎的潜在靶点，能用于快速检测和诊断。