[发明专利]猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒，属于生物技术领域。 

背景技术

猪圆环病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)，包括猪皮炎与肾炎综合症(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合症(PRDC)等疾病，主要的临床特点为进行性消瘦，衰弱及呼吸困难和淋巴结肿大，有时可见腹泻，苍白，黄疸。该病的发病率及死亡率差异很大，急性暴发时死亡率可达15％以上；主要的病理变化为淋巴细胞缺失，淋巴样组织的细胞浸润、间质性肺炎、不同程度的肝炎及间质性肾炎。目前PCV2已经在全世界广泛流行，我国的PMWS抗体阳性率随猪的年龄的增长而上升。王忠田等和孙泉云等对国内规模化猪场的血清学调查表明，我国规模化猪场中已经广泛存在PCV2的感染，该病的发生会引起混合感染，给我国的养猪业造成很大的经济损失。 

目前国内对该病毒的实验室检测方法主要包括有：(1)多重PCR检测：该方法可对PCV2进行检测和定型。该方法灵敏度较高，特异性强，但是不能够检测极低病毒含量的临床样品。(2)定量竞争性PCR检测：该方法可以通过PCR的产物量来推断其原始的病毒的核酸含量，可以用于病毒含量的检测。该方法特异性高，但是存在检测灵敏度不高的问题。(3)间接荧光免疫试验：该实验方法可以对PCV进行检测和定型，该方法敏感性不高，不能有效检测低病毒含量的样品，并且在结果判断上容易受荧光抗体质量及操作人员主观意识影响较大。(4)免疫组织化学技术检测：该技术可以检测到病毒在细胞组织内存在的部位。检测的敏感性高，但是容易受所使用的抗体质量及操作技术的影响。(5)酶联免疫吸附试验：该方法是血清学检验的主要方法，通过检测机体特异性抗体来指示病毒感染的阳性率。该方法的局限性在于不能够准确检测到病毒含量即病毒载量。(6)原位核酸杂交试验：通过检测PCV2的核酸的量来指示器官 受感染病毒含量的程度。该方法具有很高的敏感性，特异性也极高。但是操作上需要转膜需要一定的时间，操作不够简便。 

发明内容

本发明的目的是建立一种猪圆环病毒II型(PCV2)SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的引物对，SYBR Green I是一种DNA结合染料，可以实现对起始模板的定性和定量。 

本发明的另一目的是提供该引物对在制备猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，该试剂盒可用于动物及动物源性食品猪圆环病毒II型(PCV2)含量的检测，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测。 

本发明的目的是通过如下技术方案实现的： 

本发明提供一种猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为：引物P1(上游)：5’-GTATTCAAAGGGCACAGAG-3’和引物P2(下游)：5’-TACTATCAAGCGAACCACA-3’。 

本发明的上述引物对是按照如下方法设计的：(1)根据PCV2病毒的基因组序列，以ORF2序列为目的序列，找到其保守序列区；(2)将该保守序列区与PCV1的基因序列进行比较，选取一段与该序列差异最大的区域进行引物设计；(3)特异性引物的设计，引物设计主要满足以下几个要求：A、所设计的引物序列的GC含量要控制在45％～60％；B、两个引物的Tm值不要相差超过5℃；C、引物的5’端避免是AAA或者TTT的连续序列；以提高引物与序列的结合能力；D、所设计的引物扩增的目的片段的大小最好在300bp之内。 

本发明的引物对可用于制备猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测试剂盒，从而对猪圆环病毒II型(PCV2)进行病毒含量的检测，该试剂盒包括：(1)阳性对照标准品：为含有PCV2ORF2序列的克隆质粒pMD-18T-ORF2，质粒的最终浓度为1×10¹²copies/μl；(2)阴性对照：提取PCV2阴性的猪的血液、组织的DNA，通过普通PCR检测结果为阴性的样品作为阴性对照品；(3)PCR反应液：每个反应的反应液包括提取的模板DNA，引物，SYBRGreen I荧光染料溶液(SYBR Green I荧光染料，dNTP，反应缓冲液)，Taq酶，ddH₂O。